田 河，王志龍，張智慧，宋 靜，高 強(qiáng)，吳 影，南錫浩，郭振海，邸彥橙

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，牡丹江 157011)

腎結(jié)石是泌尿外科常見疾病之一，而草酸鈣結(jié)石是最為常見的結(jié)石類型[1]。故通過研究草酸鈣腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制具有廣泛概括意義。一些研究證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞在高濃度的草酸和尿鈣通過脂質(zhì)過氧化的情況下嚴(yán)重受損。腎結(jié)石的形成是一個復(fù)雜的過程，其形成與腎上皮細(xì)胞損傷相關(guān)，高草酸會損傷腎上皮細(xì)胞和細(xì)胞膜，然而晶體粘附是腎結(jié)石形成的重要環(huán)節(jié)，粘附的前提一般存在腎上皮細(xì)胞的損傷，這可能與損傷的腎上皮細(xì)胞為晶體提供粘附位點(diǎn)有關(guān)[2]。晶體粘附后進(jìn)一步誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步損傷腎上皮細(xì)胞。因此腎小管細(xì)胞損傷被認(rèn)為是腎晶體形成的主要危險因素。減輕高草酸引起的腎上皮細(xì)胞的損傷可能對于研究腎結(jié)石的形成具有重要的意義，對于腎結(jié)石預(yù)防尤為重要[3]。

白藜蘆醇化學(xué)名為芪三酚(3,5,4-trihydroxystilbene)，是葡萄屬植物產(chǎn)生的一種多酚類植物抗毒素，主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中，是天然的抗氧化劑和自由基清除劑[4]。且RSV是SIRT1的特異性激動劑，而近年來研究表明白藜蘆醇作為一種具有多種生物學(xué)功能化合物，具有降血脂、抗氧化損傷、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、抗衰老、保肝、免疫調(diào)節(jié)及雌激素樣作用。白藜蘆醇可通過激活SIRT1而減少氧化應(yīng)激對草酸誘導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。EX527是一種有效的、選擇性sirt1抑制劑，EX527有效抑制SIRT1去乙?；富钚?。對于研究白藜蘆醇對于HK-2的防護(hù)性機(jī)制具有重要作用。白藜蘆醇在草酸鈣結(jié)石中的抗氧化應(yīng)激機(jī)制及其對Nrf2-ARE途徑的作用，目前國內(nèi)外研究還較少。因此，研究SIRT1激動劑白藜蘆醇等能否通過信號通路維持氧自由基穩(wěn)定、抵抗草酸引起的氧化應(yīng)激損傷為白藜蘆醇等中成藥在腎結(jié)石疾病的防治應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人腎上皮細(xì)胞(HK-2)購自于ATCC。HK-2屬于貼壁細(xì)胞，細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%FBS，細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液。

1.2 主要試劑

白藜蘆醇、EX527、活性氧檢測試劑盒、相關(guān)ELISA試劑盒購自于碧云天生物科技有限公司；Sirt1、Keap1、Nrf2、HO-1抗體購自于CST；SiRNA-Sirt1購自于Sangon Biotech；RPMI1640培養(yǎng)基與FBS購自于Gibco。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：將HK-2細(xì)胞分為對照組、草酸組、草酸+RSV、草酸+RSV+EX527組。

1.3.2 白藜蘆醇藥物毒性的篩選

(1)細(xì)胞鋪板：96孔板，每孔鋪8000個HK-2細(xì)胞。(2)鋪板10 h后進(jìn)行藥物干預(yù)，藥物濃度分別為0 nM(con)、100 nM、500 nM、1 μM、5 μM。藥物干預(yù)24 h后進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)。(3)棄除上清，每孔按CCK8試劑/培養(yǎng)基10∶100的比例加入混合液。(4)2 h后于酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

1.3.3 RSV對于HK-2細(xì)胞增殖的作用

將HK-2細(xì)胞分為對照組、草酸組、草酸+RSV、草酸+RSV+EX527組。各組進(jìn)行24 h干預(yù)后進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)檢測HK-2增殖活性，CCK8方法同前。

1.3.4 Western blot法檢測RSV激動sirt1后各蛋白表達(dá)

(1)實(shí)驗(yàn)分組：將HK-2細(xì)胞分為對照組、草酸組、草酸+RSV、草酸+RSV+EX527組。(2)細(xì)胞鋪板：每中皿鋪8×105個細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行干預(yù)。(3)蛋白提取，干預(yù)處理24 h后，裂解液裂解，隨后4℃，14 000 r/min 離心10 min，隨后取上清按5×比例加入上樣緩沖液，隨后100℃水浴10 min。隨后進(jìn)行蛋白凝膠電泳及顯像分析。

1.3.5 qPCR法檢測各組HK-2中基因表達(dá)情況

運(yùn)用TRIzol法提取HK-2細(xì)胞中的總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL∶1 μL總RNA，4 μL 5×Reaction Mix，2 μL 10×Super Script Enzyme Mix，加入ddH2O將體系補(bǔ)足至20 μL，混勻后離心。反應(yīng)條件為：37℃ 60 min，95℃ 5 min，置于4℃保存?zhèn)溆?。按照qPCR試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL。使用SYBR Green染料法進(jìn)行測定，每個樣本設(shè)置4個復(fù)孔。按照試劑盒說明書的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量用2-△△CT法進(jìn)行計算。引物序列如下：

β-actin 正向序列：5’-CATTGCTGACAGGATG CAGAAGG-3’；反向序列：5’-TGCTGGAAGGTGG ACAGTGAGG-3’；

sirt1正向序列：5’-TAGACACGCTGGAACA GGTTGC-3’，反向序列5’-CTCCTCGTACAGCTT CACAGTC-3’；

TGF-β1正向序列：5’-TACCTGAACCCGTGTT GCTCTC-3’，反向序列：5’-GTTGCTGAGGTAT CGCCAGGAA-3’；

SMAD2正向序列：5’-GGGTTTTGAAGCCGTC TATCAGC-3’，反向序列：5’-CCAACCACTGTAGA GGTCCATTC-3’；

Nrf2正向序列：5’-CACATCCAGTCAGAAACC AGTGG-3’，反向序列：5’-GGAATGTCTGCGCCAA AAGCTG-3’。

1.3.6 流式細(xì)胞儀測定HK-2干預(yù)后活性氧水平

實(shí)驗(yàn)分組同前。(1)細(xì)胞鋪板，6孔板每孔鋪4×105個細(xì)胞。貼壁后進(jìn)行干預(yù)處理。(2)24 h后進(jìn)行活性氧檢測，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次。(3)流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.7 ELISA法測各組中TGF-β1、Smad2、sirt1和Nrf2含量

細(xì)胞上清樣品離心取上清(500 r/min，5 min)，隨后-80℃樣品保存。采用ELISA法測量各組HK-2細(xì)胞中TGF-β1、Smad2、sirt1和Nrf2含量。

1.3.8 siRNA干擾各組sirt1表達(dá)后，Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

(1)胞鋪板：24孔板接種5萬個細(xì)胞每孔，每孔中加入約500 μL含血清的完全培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度能夠達(dá)到70%。(2)采取稀釋后的lipo2000與稀釋后的siRNA混勻孵育后感染細(xì)胞。(3)24 h后觀察熒光。Western blot實(shí)驗(yàn)方法同前。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇藥物毒性的篩選

如圖1所示，白藜蘆醇藥物毒性實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，白藜蘆醇對于HK-2無毒性，統(tǒng)計學(xué)無明顯差異(P>0.05)。而其他濃度的白藜蘆醇均對HK-2有著不同程度的抑制作用，而且這種抑制作用與RSV的濃度梯度相關(guān)，表明RSV大于500 nM后，對于HK-2細(xì)胞存在明顯的藥物毒性作用。

2.2 白藜蘆醇對于HK-2細(xì)胞增殖的作用

如圖2所示，CCK8實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，草酸鈉抑制了HK-2的增殖(P<0.01)。與草酸鈉組相比，RSV緩解了草酸鈉對于HK-2的損傷(P<0.01)，但EX527解除了RSV對HK-2細(xì)胞的增殖作用(P<0.01)。

2.3 流式細(xì)胞儀測定HK-2干預(yù)后活性氧水平

如圖3所示流式細(xì)胞儀檢測各組活性氧水平結(jié)果表明，草酸鈉刺激HK-2活性氧的產(chǎn)生，然而RSV干預(yù)后的HK-2,草酸鈉刺激其產(chǎn)生活性氧的水平下降，應(yīng)用sirt1抑制劑的EX527后，活性氧的產(chǎn)生水平恢復(fù)到原先水平。

2.4 Western blot法檢測 RSV激動sirt1后各蛋白表達(dá)

如圖4所示，與對照組相比，草酸鈉組HK-2細(xì)胞中sirt1表達(dá)下降，Keap1、Nrf2、HO-1表達(dá)降低,Smad2表達(dá)上調(diào)。與草酸鈉組相比，RSV應(yīng)用后，sirt1表達(dá)上調(diào)，Keap1、Nrf2、HO-1表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Smad2/3表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。然而應(yīng)用EX527后，sirt1上調(diào)的相關(guān)蛋白表達(dá)下降。

注：NS：無統(tǒng)計學(xué)意義。圖1 白藜蘆醇藥物毒性的篩選Note. NS, not statistically significantFigure 1 Selecting of drug toxicity of resveratrol

2.5 qPCR法檢測各組HK-2中基因表達(dá)情況

如圖5所示，與對照組相比，草酸鈉組TGF-β1、Smad2/3/4mRNA表達(dá)上調(diào)，而sirt1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。與草酸鈉組相比，應(yīng)用RSV后TGF-β1(P<0.01)，Smad2(P<0.05)、Smad3(P<0.05)、Smad4(P<0.01)mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，而sirt1 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。應(yīng)用sirt1抑制劑后,與RSV組相比，TGF-β1(P<0.01)、Smad2/3/4(P<0.05)表達(dá)上調(diào)，sirt1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。

2.6 siRNA干擾各組sirt1表達(dá)后，Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

如圖6所示，應(yīng)用siRNA-sirt1感染HK-2細(xì)胞后，Western blot 檢測sirt1的表達(dá)，與NC組相比，siRNA組sirt1表達(dá)明顯下調(diào)。如圖7所示，與草酸鈉組相比，siRNA干擾后，sirt1表達(dá)下調(diào)，Keap1、Nrf2、HO-1表達(dá)下調(diào)。沉默sirt1表達(dá)后，隨后應(yīng)用RSV，發(fā)現(xiàn)RSV并不能抑制Smad2/3的激活。這與EX527作用相同。

圖2 白藜蘆醇對于HK-2細(xì)胞增殖的作用Figure 2 Effect of resveratrol on proliferation of HK-2 cells

圖3 流式細(xì)胞儀測定HK-2干預(yù)后活性氧水平Figure 3 Flow cytometry was used to determine the level of reactive oxygen species after HK-2 intervention

圖4 Western blot法檢測 RSV激動sirt1后各相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 4 Western blot analysis of expression of related proteins after RSV activation of sirt1

圖5 qPCR法檢測各組HK-2中基因表達(dá)情況Figure 5 qPCR analysis of gene expression in each group of HK-2

圖6 siRNA干擾HK-2細(xì)胞sirt1表達(dá)Figure 6 siRNA interferes with sirt1 expression in HK-2 cells

圖7 siRNA干擾sirt1表達(dá)后，Western blot法檢測各實(shí)驗(yàn)組相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 7 After siRNA interfered with the expression of siut1, Westem blot assay was used to detect the expression of related proteins in each experimental group

3 討論

氧化應(yīng)激是由于活性氧(ROS)產(chǎn)生超過機(jī)體抗氧化能力而產(chǎn)生的。超過90%的ROS產(chǎn)生于呼吸鏈的線粒體中[4]。此外NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂肪氧合酶也會增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS的產(chǎn)生。在氧化應(yīng)激存在時，機(jī)體的抗氧化能力減弱，能清除ROS的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及過氧化氫酶(CAT)等的含量降低，導(dǎo)致ROS的過度積聚[5]。而NADPH氧化酶中的核心部分p22phox會促使ROS的產(chǎn)生[6]。草酸作用細(xì)胞后會引起細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧,進(jìn)而對細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷。而體外實(shí)驗(yàn)中加入活性氧清除劑N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)可減弱草酸對細(xì)胞的損傷。

機(jī)體在應(yīng)對 ROS 損害時形成一套復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)，自身會誘導(dǎo)出一系列保護(hù)性蛋白，以減輕細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷[7]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子 NF-E2 相關(guān)因子 2 (Nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)和它的胞質(zhì)接頭蛋白(Kelch like ECH associated protein 1, Keap1)是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者[8]。正常情況下，Nrf2 和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 Keap1 結(jié)合成二聚體的形式存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后，Nrf2與 Keap1 解離并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，然后通過與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件 ARE相互作用，誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白和 II 相解毒酶的表達(dá)，如γ谷氨酸合成酶(γ-GCS)血紅素氧合酶 1(HO-1)等[9]。故當(dāng)受到氧化應(yīng)激損傷時，機(jī)體會產(chǎn)生相應(yīng)的自身防御反應(yīng)，Keap1-Nrf2/ARE 通路是近年新發(fā)現(xiàn)的機(jī)體抵抗外界氧化和化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6]。Keap1-Nrf2/ARE通路下游的抗氧化酶HO-1是血紅素降解過程中的限速酶，研究證明，多種生長因子、氧化刺激因素、抗氧化藥物等能上調(diào)其表達(dá)[2]。而HO-1催化血紅素降解的三個產(chǎn)物: CO、膽紅素和鐵蛋白, 是發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的關(guān)鍵分子[10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HO-1對細(xì)胞和組氧化損傷起著重要的保護(hù)作用。故HO-1被認(rèn)為是細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中一個非常敏感的指標(biāo)[11]。

SIRT1 (沉默信息調(diào)節(jié)因子1)是NAD+ 依賴性蛋白脫乙酰酶，在細(xì)胞分化、衰老、凋亡、代謝調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)到、氧化應(yīng)激等多種重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[12]。而這種作用主要是通過去乙酰化激活NF-KB、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族(FOXOs)、過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)及其輔激活因子PGC1等[13]。既往研究已經(jīng)證實(shí)SIRT1可通過抗炎、抗氧化、減少凋亡等機(jī)制發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[2]。

本實(shí)驗(yàn)篩選了白藜蘆醇的最佳藥物劑量，同時發(fā)現(xiàn)不同濃度的白藜蘆醇存在不同程度放入藥物抑制作用。高草酸的環(huán)境對于人腎上皮細(xì)胞(HK-2)具有損傷作用，損傷可能通過抑制sirt1表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，因此應(yīng)用sirt1的激動劑具有較好的防護(hù)性作用。RSV可以在適當(dāng)藥物濃度下明顯抑制草酸鈉誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生水平。這可能與sirt1被激活后，通過平衡Keap1/Nrf2/HO-1與TGF-β1發(fā)揮抗氧化，抗草酸鈣晶體粘附的作用有關(guān)。據(jù)研究表明心肌細(xì)胞Nrf2可以抑制TGF-β1/Smad2/3/4信號通路。因此，白藜蘆醇激動sirt1后，上調(diào)了Keap1/Nrf2/HO-1蛋白的表達(dá)，然而Nrf2表達(dá)上調(diào)后進(jìn)一步抑制了TGF-β1的產(chǎn)生水平，從而發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而緩解了草酸鈉對于HK-2細(xì)胞的損傷作用。本實(shí)驗(yàn)隨后又運(yùn)用sirt1及抑制劑對于白藜蘆醇的作用及機(jī)制進(jìn)行反向驗(yàn)證，研究進(jìn)一步表明白藜蘆醇激動sirt1后具有良好的防護(hù)性效應(yīng)。

綜上所述，本研究表明白藜蘆醇對于HK-2細(xì)胞抗氧化作用，其機(jī)制可能是sirt1激活后，促進(jìn)了Keap1、Nrf2、HO-1的表達(dá)，并進(jìn)一步抑制了TGF-β1產(chǎn)生水平，從而抑制了ROS的產(chǎn)生。