何琦琳，郎巧利，余 琳，黃 楠，楊 希，葛良鵬

(重慶市畜牧科學院，重慶市醫(yī)用動物資源開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一種表達于細胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白類聚糖，通過細胞膜上的糖基磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)錨定連接于細胞表面[1-2]。人GPC3基因位于人染色體Xq26上，編碼580個氨基酸，核心蛋白約70×103，在第358位和359位氨基酸之間，可被弗林蛋白酶裂解成一個與膜結(jié)合的大小為30×103羧基端蛋白和一個大小為40×103的氨基末端蛋白[3-4]。GPC3與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，特別是肝癌，GPC3常在肝癌患者中高表達(72%～81%)，GPC3是原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)細胞表面特異性膜蛋白，可作為肝癌腫瘤抗原的理想靶點[5-12]。目前已開發(fā)有多個GPC3治療性抗體[13-17]，發(fā)現(xiàn)GPC3治療性抗體對HCC有明顯的抑制作用，但進入臨床以后的效果良莠不齊，研究和開發(fā)GPC3治療性抗體任重而道遠。目前，在GPC3治療性抗體的研發(fā)中，需要能穩(wěn)定高表達GPC3蛋白的肝癌細胞對抗體進行功能性驗證。其中能夠表達GPC3蛋白的肝癌細胞系有HepG2、Hep3B、HT17、HuH6、HuH7及PLC/PRF/5[18]，但大多表達量不高不能滿足研究的要求。因此，本研究將利用電穿孔法將pcDNA3.1-GPC3載體轉(zhuǎn)染至SK-Hep-1肝癌細胞中，構(gòu)建穩(wěn)定高表達人GPC3的SK-Hep-1細胞系，為進一步開發(fā)GPC3治療性抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SK-Hep-1細胞購自美國ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

AmaxaTMCell Line NucleofectorTMKit V轉(zhuǎn)染試劑購自瑞士LONZA；載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)購買自美國invitrogen公司；細胞培養(yǎng)試劑DMEM、青鏈霉素、G418及PBS均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries；0.25%胰酶購自武漢Procell；EasyPureHipure Plasmid Maxiprep Kit試劑盒購自北京全式金；Tween20和細胞裂解液均購自上海碧云天；Anti-Glypican 3 antibody、Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP)、Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor?488)抗體均購自英國abcam公司。

細胞CO2培養(yǎng)箱(eppendrof公司，德國)；Lonza電轉(zhuǎn)化儀(Lonza公司，德國)；超凈工作臺(北京哈東聯(lián))；FACSVerseTM流式細胞儀(BD，美國)；Odyssey CLx雙紅外激光成像系統(tǒng)(LICOR公司，美國)；CloneSelect Imager細胞生長分析系統(tǒng)(molecular devices公司，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 pcDNA3.1-GPC3質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

以GenBank中人的GPC3基因序列(Gene ID：2719)為參考模板，構(gòu)建人GPC3 cDNA序列至真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，重組質(zhì)粒構(gòu)建及測序由金唯智公司完成。將構(gòu)建的含重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GPC3的大腸桿菌接種至LB培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA用NheI和XbaI雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GPC3表達的GPC3蛋白不帶任何標簽。

1.3.2 SK-Hep-1細胞最佳G418篩選濃度的確定

取生長良好的SK-Hep-1細胞，消化后制備成細胞懸液，按1×104/孔接種入24孔板中，24 h后開始G418加壓。分別用含0 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、700 μg/mL、800 μg/mL、900 μg/mL、1000 μg/mL的G418篩選培養(yǎng)基進行篩選，每個梯度做3個重復，10～20 d后選擇能夠使所有細胞死亡的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。

1.3.3 SK-Hep-1細胞電轉(zhuǎn)及篩選

轉(zhuǎn)染前一天將細胞傳代至75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待貼壁細胞長至70%～90%時轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染液1管100 μL(81 μL Nucleafeceor solution，19 μL supplement)輕輕混勻，室溫放置30 min。將細胞從培養(yǎng)箱取出，棄掉液體，用PBS洗2遍，加入0.25%胰酶消化細胞后加入預(yù)熱的培養(yǎng)基終止重懸，吸至15 mL離心管1500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌一次后用1 mL PBS重懸計數(shù)，取1×104cell加至1.5 mL離心管中，1500 r/min離心5 min。吸干液體，加入100 μL轉(zhuǎn)染混合液重懸細胞沉淀。再加入總量為2 μg的質(zhì)?；旌虾蠹又岭娹D(zhuǎn)杯中，放入電轉(zhuǎn)染儀中轉(zhuǎn)染10 s。電轉(zhuǎn)完后立即取出電轉(zhuǎn)杯，加入預(yù)熱的培養(yǎng)基0.5 mL至電轉(zhuǎn)杯中，將細胞吸取至含有0.5 mL培養(yǎng)基的24孔板中，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并設(shè)置轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體的SK-Hep-1細胞作空白對照。轉(zhuǎn)染48 h后更換含有篩選濃度G418的培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)。16 d后，將篩選獲得的陽性細胞擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)后使用含篩選濃度一半的G418培養(yǎng)基維持培養(yǎng)并保存。取10代以內(nèi)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞進行后續(xù)試驗。

1.3.4 Western blot檢測GPC3蛋白表達情況

收集篩選獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞SK-Hep-1-GPC3，加入細胞裂解液，用槍反復吹打后孵育3 min裂解細胞。取裂解后細胞上清，向樣品中加入上樣緩沖液及還原劑，沸水煮5 min后進行SDS-PAGE電泳，再電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，再anti-Glypican-3 antibody(稀釋比例為1∶3000)4℃孵育過夜。PBST洗3次后，加入Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP)(稀釋比例為1∶8000)室溫孵育1 h，PBST洗3次后，用Odyssey CLx儀器進行掃描成像。

1.3.5 流式檢測細胞表面GPC3表達情況

將生長良好的SK-Hep-1-GPC3細胞消化后，用PBS(含有2% FBS)稀釋成5×105/mL的細胞懸液，800 r/min 4℃離心5 min。加入Anti-Glypican-3 antibody抗體，4℃孵育30 min，PBS洗細胞2次后加入Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor?488)，PBS洗細胞2次，再加入500 μL的PBS重懸，用BD FACSVerseTM進行流式檢測。

2 結(jié)果

2.1 GPC3的合成及表達載體構(gòu)建

本實驗根據(jù)NCBI中公布的GPC3序列(Gene ID: 2719)合成了GPC3基因序列并插入到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建pcDNA3.1-GPC3重組質(zhì)粒。經(jīng)測序檢測證明插入序列與公布的GPC3序列一致(部分測序圖見圖1)。

圖1 部分測序圖Figure 1 Part of the sequencing map

2.2 重組真核表達質(zhì)粒鑒定

重組的pcDNA3.1-GPC3質(zhì)粒提取后，經(jīng)NheI和XbaI雙酶切后，獲得兩條片段，與預(yù)期條帶大小一致(見圖2)。

注：1：質(zhì)粒pcDNA3.1-GPC3；2：雙酶切重組質(zhì)粒；3：DL5000 marker。圖2 pcDNA3.1-GPC3重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Note. 1, pcDNA3.1- GPC3; 2, Double enzymes digestion of pcDNA3.1-GPC3; 3, DL5000 marker.Figure 2 Identification of pcDNA3.1-GPC3 digested by NheI and XbaⅠ

2.3 SK-Hep-1細胞最佳G418篩選濃度確定

G418篩選7 d后細胞開始大量死亡(圖3A)，篩選后第15天，700 μg/mL組細胞死亡80%(圖3B)，第20天細胞全部死亡的最小G418濃度為700 μg/mL(圖3C)，未轉(zhuǎn)染細胞生長狀態(tài)良好(圖3D)。故SK-Hep-1 G418最佳篩選濃度為700 μg/mL。

注：A：第7天(G418濃度為700 μg/mL組)；B：第15天(G418濃度為700 μg/mL組)；C：第20天(G418濃度為700 μg/mL組)；D：對照細胞(未加G418)。圖3 最佳G418篩選濃度的確定Note. A, Culture at the seventh day (700 μg/mL group). B, Culture at the 15th day (700 μg/mL group). C, Culture at the twentieth day (700 μg/mL group). D, Control cells (0 μg/mL group).Figure 3 Determination of the optimal screening concentration of G418

2.4 Western blot檢測GPC3的表達

Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞GPC3的表達，同時與HepG2細胞的GPC3蛋白表達量進行比較，結(jié)果顯示SK-Hep-1細胞不能表達GPC3蛋白，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞SK-Hep-1-GPC3能夠表達GPC3蛋白，并且表達量顯著高于HepG2細胞(見圖4)。

2.5 流式細胞檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞表面GPC3的表達

利用流式細胞術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系SK-Hep-1-GPC3細胞表面GPC3的表達，同時用正常的未轉(zhuǎn)染SK-Hep-1細胞作對照，結(jié)果獲得細胞表明GPC3蛋白陽性率為100%的穩(wěn)定細胞系(見圖5)。

圖4 Western blotFigure 4 Western blot

圖5 流式細胞術(shù)Figure 5 Flow cytometry

3 討論

癌癥一直以來給人類生命健康造成了巨大的危害，在我國癌癥已經(jīng)位居主要疾病死亡率的首位。其中我國肝癌(主要是原發(fā)性肝細胞癌)的病例數(shù)占全球的46.7%，成為我國第二大癌癥，其發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[19-21]。因此，肝癌研究在中國意義重大，越來越多的中國專家學者開展了相關(guān)研究[22-26]。由于大部分肝癌發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，采取靶向治療和免疫治療的研究越來越多，出現(xiàn)了許多分子靶向藥物和治療性抗體來靶向治療肝細胞癌[27]。研究與開發(fā)肝癌特異性靶點藥物具有十分重要意義。GPC3在肝細胞瘤組織中高表達，而在正常肝組織中幾乎不表達，其是HCC病理診斷的腫瘤標志物[28-30]，也是肝癌治療性抗體研發(fā)的新靶點。能否獲得靶蛋白高效表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系是抗體藥物開發(fā)的關(guān)鍵。然而，目前可購買的野生型肝癌細胞中，細胞表面GPC3表達量均相對較低。本研究根據(jù)NCBI中報道的GPC3序列，成功構(gòu)建了真核表達載體pcDNA3.1-GPC3，酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符(圖2)。通過電穿孔法成功將pcDNA3.1-GPC3轉(zhuǎn)染至SK-Hep-1，并通過G418篩選獲得穩(wěn)定表達GPC3的SK-Hep-1-GPC3細胞系。Western bolt和流式鑒定細胞表面GPC3表達情況(圖4和圖5)，表明SK-Hep-1-GPC3細胞系能在細胞表面穩(wěn)定表達GPC3蛋白，且其表達量較能天然表達GPC3的HepG2細胞更高。

本研究采用電穿孔轉(zhuǎn)染方法將pcDNA3.1-GPC3轉(zhuǎn)染至SK-Hep-1細胞，并篩選獲得了穩(wěn)定高表達GPC3的SK-Hep-1-GPC3的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，為進一步研究與開發(fā)治療性GPC3抗體奠定了基礎(chǔ)。