龐榮清，朱 慧,2，鄢東海,3，王 強(qiáng)，李自安，王金祥，于倩倩，阮光萍，朱向情，潘興華*

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032；2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000； 3.巴東縣人民醫(yī)院，湖北 巴東 444300)

由于取材方便、適于規(guī)?；a(chǎn)、細(xì)胞增殖活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)成為再生醫(yī)學(xué)研究最為廣泛的種子細(xì)胞之一，是一種具有良好發(fā)展前景的細(xì)胞藥物[1]。干細(xì)胞具有傳統(tǒng)藥物所不具備的增殖能力、靶向遷移能力、自分泌能力等生物學(xué)特性，是現(xiàn)代藥代動(dòng)力學(xué)研究的巨大挑戰(zhàn)。顯然傳統(tǒng)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估藥物吸收、分布、代謝的體系并不適于細(xì)胞藥物的評(píng)估，監(jiān)測(cè)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布和清除才是關(guān)鍵[2]。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記是穩(wěn)定的體內(nèi)示蹤方法[3]，結(jié)合活體成像技術(shù)是監(jiān)測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)分布的有效手段[4]。

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)是一種以骨骼肌、膈肌進(jìn)行性變性、壞死為主要病理特征的遺傳性肌病，在出生男嬰中的檢出率約為1/3500。由于其家族遺傳性的特點(diǎn)，目前尚無(wú)有效治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞具有一定的再生和修復(fù)肌肉的作用，是肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的潛在治療藥物[5]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究已成功分離、擴(kuò)增和純化小鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse umbilical cord mesenchymal stem cell, mUCMSC)[6]，還從英國(guó)引入DMD治療研究最常用的X-連鎖肌萎縮(X-linked muscular dystrophy，mdx)小鼠，采用GFP示蹤結(jié)合活體成像技術(shù)，觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入mdx小鼠腹腔后的清除速率和組織靶向性,為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用于肌病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

經(jīng)鑒定5只清潔級(jí)mdx小鼠，雌性3只，雄性2只，體重22～26 g，確定性別后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(1♂2♀)和對(duì)照組(1♂1♀),48周齡(這個(gè)年齡已出現(xiàn)明顯腓腸肌、膈肌損傷)，由英國(guó)牛津大學(xué)Davies教授惠贈(zèng)(動(dòng)物入境檢疫許可證號(hào)為AD44010011)，飼養(yǎng)于原成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)環(huán)境實(shí)驗(yàn)室[SYXK(滇)2015-0011]。經(jīng)過(guò)原成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究(審批號(hào)：2016011號(hào))。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》、按照3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

C57小鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mUCMSC)來(lái)自于作者所在云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，即復(fù)蘇經(jīng)免疫表型鑒定和誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定合格的第三代mUCMSC用于實(shí)驗(yàn)研究。Lenti慢病毒載體液為上海吉滿生物科技有限公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基DMEM/F12、胎牛血清、0.25%EDTA-胰蛋白酶為Hyclone公司產(chǎn)品；80i熒光顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。小動(dòng)物活體成像儀FluorVivo，為環(huán)亞生物科技公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 mUCMSC的GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記

按照前期建立的mUCMSC培養(yǎng)方法[6]，將鑒定合格凍存的第三代mUCMSC快速解凍，移至50 mL離心管內(nèi)加入生理鹽水充分混勻后離心，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)移至多個(gè)175 cm2培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)24 h，按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)MOI值為150的劑量加入慢病毒載體共培養(yǎng)72 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。消化收集慢病毒載體共培養(yǎng)72 h的mUCMSC，加入生理鹽水制成細(xì)胞濃度為每毫升1.25×107個(gè)的細(xì)胞懸液備用。

1.3.2 腹腔注射及活體成像觀察

實(shí)驗(yàn)組3只mdx小鼠，仰臥位固定，酒精消毒腹壁后將其微微提起，小心穿刺，確保注射器針尖進(jìn)入腹腔空隙但不進(jìn)入腸管或其它臟器，每只腹腔一次性注射0.4 mL 生理鹽水細(xì)胞懸液(含5×106個(gè)GFP標(biāo)記的第三代mUCMSC)，對(duì)照組2只mdx小鼠對(duì)照僅注射0.4 mL 生理鹽水。在移植后1 h、3 h、5 h、24 h、1周用小動(dòng)物活體成像儀觀察小鼠腹壁注射細(xì)胞局部和腹腔熒光信號(hào)的分布，并確定臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的清除速率。

1.3.3 膈肌組織學(xué)鏡檢觀察

參照前期建立的方法[7]，活體成像觀察結(jié)束立即處死實(shí)驗(yàn)小鼠切取膈肌，采集每只鼠膈肌的左、中、右3小塊，分別置于固定架上滴加包埋劑，固化后每小塊膈肌制作冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)10倍鏡下每個(gè)視野內(nèi)熒光信號(hào)點(diǎn)，每小塊膈肌計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每只鼠左、中、右3小塊膈肌共計(jì)數(shù)15個(gè)視野。比較分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記的mUCMSC

按照最佳MOI值150的劑量加入慢病毒載體與mUCMSC共培養(yǎng)72 h后，熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)大量貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的綠色熒光(圖1A)。這些散發(fā)綠色熒光的mUCMSC，用0.25% trypsin-EDTA消化傳代3代，熒光亮度無(wú)明顯衰減(圖1B)。

注：A:GFP標(biāo)記的mUCMSC；B:傳代的GFP標(biāo)記的mUCMSC。圖1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染標(biāo)記的mUCMSCNote. A, mUCMSC-labeled GFP. B, Passaged mUCMSC-labeled GFP.Figure 1 mUCMSC-labeled by GFP lentiviral vector transfection

2.2 體內(nèi)mUCMSC的分布和降解

0.4 mL生理鹽水懸浮的5×106個(gè)GFP標(biāo)記的mUCMSC，一次性注射到mdx小鼠腹腔后1 h、3 h、5 h，在小動(dòng)物活體成像儀綠色熒光通道下觀察到腹壁下注射細(xì)胞的部位有明亮的綠色熒光集中分布，只是熒光輪廓不斷縮小(圖2A、2B、2C)。24 h后熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?(圖2D)，2只mdx小鼠甚至不能確定輪廓。一周后，所有小鼠腹部均觀察不到熒光信號(hào)。為進(jìn)一步觀察腹腔內(nèi)部綠色熒光信號(hào)的分布，將mdx小鼠處死后剪開(kāi)腹壁，暴露整個(gè)腹腔臟器，可在小動(dòng)物活體成像儀綠色熒光通道下觀察到腹壁內(nèi)側(cè)和器官表面有少許熒光點(diǎn)分布(圖2E)，而注射未標(biāo)記GFP的mUCMSC的對(duì)照小鼠檢測(cè)不到典型的明亮綠色熒光的存在(圖2F)。為了觀察GFP標(biāo)記的mUCMSC在mdx小鼠體內(nèi)的降解變化趨勢(shì)，把實(shí)驗(yàn)組(n=3)確定的熒光輪廓測(cè)定出平均熒光面積，mUCMSC注射后1 h、3 h、5 h平均熒光面積依次為(36.5±2.3) mm2、(33.8±2.6) mm2、(30.9±3.5) mm2。把確定不了熒光輪廓時(shí)和以后的平均熒光面積視為0，就可發(fā)現(xiàn)，熒光面積隨著細(xì)胞注射后的時(shí)間延長(zhǎng)呈不斷縮減的趨勢(shì)(圖2G)，尤其是細(xì)胞注射后5 h后呈現(xiàn)快速消減趨勢(shì)。

注：A:注射后1 h；B:注射后3 h；C:注射后5 h；D:注射后24 h；E:注射后1周(168 h)腹腔內(nèi)臟；F:對(duì)照mdx小鼠；G：變化趨勢(shì)圖。圖2 局部注射GFP-mUCMSC后mdx小鼠腹部熒光信號(hào)分布及變化趨勢(shì)分析Note. A, 1 h after injection. B, 3 h after injection. C, 5 h after injection. D, 24 h after injection. E, Abdominal cavity 1 week after injection. F, Control mdx mice. G, Change tendency chart.Figure 2 Fluorescence signal distribution and change tendency analysis in the abdomen of mdx mice after local GFP-mUCMSC injection

2.3 鏡檢觀察膈肌內(nèi)mUCMSC的分布

注射細(xì)胞1周后的mdx小鼠膈肌冰凍切片內(nèi)，在熒光顯微鏡下，每只鼠的左、中、右部位均可在膈肌橫斷面觀察到少許綠色熒光信號(hào)散在分布(圖3A，3A-1,3A-2)，對(duì)照組小鼠膈肌橫斷面觀察不到綠色熒光信號(hào)(圖3B)。按照每個(gè)部位5個(gè)視野，每只鼠共計(jì)數(shù)15個(gè)視野(n=15)計(jì)算，每只鼠膈肌內(nèi)有(2.9±2.2)個(gè)綠色熒光信號(hào)，與未注射細(xì)胞的對(duì)照組有顯著差異(P﹤0.05)(圖3C)。

注：A：實(shí)驗(yàn)組mdx小鼠(合成圖)；A-1：GFP；A-2：DAPI；B：對(duì)照mdx小鼠；C：比較分析圖。*P<0.05圖3 注射后1周mdx小鼠膈肌組織內(nèi)熒光信號(hào)分布鏡檢觀察及比較分析Note. A, Experiment group mdx mice(merged). A-1, GFP. A-2, DAPI. B, control mdx mice. C, Comparison analysis chart.*P<0.05Figure 3 Fluorescence signal distribution observed by fluorescence microscope in the diaphragm of mdx mice at 1 week post injection and comparison analysis

3 討 論

建立穩(wěn)定可靠的體內(nèi)示蹤技術(shù)，是動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)移植的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移分布、開(kāi)展間充質(zhì)干細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)研究的前提[8]。本研究顯示：按照最佳MOI值150的劑量加入慢病毒載體與mUCMSC共培養(yǎng)，可以成功使mUCMSC轉(zhuǎn)染GFP，在特定波長(zhǎng)光照條件下發(fā)出綠色熒光，傳代3代，熒光亮度不會(huì)明顯衰減，這暗示GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記的mUCMSC可用于體內(nèi)短期示蹤。GFP基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記的細(xì)胞，在特定波長(zhǎng)的光照激發(fā)下就會(huì)發(fā)出綠色熒光[9]，結(jié)合活體成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)植入細(xì)胞的適時(shí)動(dòng)態(tài)觀察。

靜脈途徑給藥是間充質(zhì)干細(xì)胞治療常用的方法，但我們的前期研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射大量間充質(zhì)干細(xì)胞治療mdx小鼠極易引發(fā)小鼠栓塞死亡[7]。腹腔注射法操作簡(jiǎn)單，不存在引發(fā)肺栓塞的危險(xiǎn)，而且腹腔注射與靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞的效果沒(méi)有差別[10-11]，本研究顯示：一次性腹腔注射大劑量細(xì)胞給腓腸肌、膈肌等肌組織進(jìn)行性變性壞死的mdx小鼠，1 h后可在注射細(xì)胞的腹壁下觀察到明亮的綠色熒光集中分布，隨后熒光面積逐漸縮小，24 h后熒光面積大幅縮小，熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?，一周后，腹部觀察不到熒光信號(hào)，這與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)研究的報(bào)道類似[12]。為了進(jìn)一步觀察腹腔內(nèi)部綠色熒光信號(hào)的分布，本研究將mdx小鼠處死后剪開(kāi)腹壁，暴露整個(gè)腹腔臟器，可在小動(dòng)物活體成像儀綠色熒光通道下觀察到腹壁內(nèi)側(cè)和器官表面有少許熒光點(diǎn)分布。這表明：注射到mdx小鼠腹腔內(nèi)的GFP標(biāo)記的mUCMSC在24 h之內(nèi)細(xì)胞數(shù)量在不斷減少或者細(xì)胞濃度在不斷降低。C57小鼠來(lái)源的mUCMSC，轉(zhuǎn)染GFP不會(huì)影響其免疫原性低的生物學(xué)特性。因此，注射同種異體mUCMSC到與C57小鼠同源的mdx小鼠腹腔，不會(huì)很快被mdx小鼠免疫細(xì)胞清除，注射到腹腔的細(xì)胞在mdx小鼠體內(nèi)可能存在1周，24 h內(nèi)腹壁熒光信號(hào)大幅減弱的主要原因是細(xì)胞濃度降低所致，很有可能與腸管蠕動(dòng)造成的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)有關(guān)，也可能是受到全身肌肉損傷而產(chǎn)生的趨化因子的招募作用而形成的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)有關(guān)?；铙w成像技術(shù)不能觀察到注射細(xì)胞后1周的mdx小鼠腹腔存在明顯熒光時(shí)，采用熒光顯微鏡檢測(cè)方法還可在mdx小鼠膈肌內(nèi)觀察到熒光信號(hào)的存在，表明擅長(zhǎng)于整體觀察的小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)GFP熒光信號(hào)的靈敏度遠(yuǎn)低于擅長(zhǎng)于微觀觀察的熒光顯微鏡，注射到腹腔的mUCMSC可以進(jìn)入膈肌，其遷移機(jī)制可能與mdx小鼠的損傷膈肌釋放的炎癥因子的靶向招募有關(guān)[13-14]，具體遷移及作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。