牟文波，李 慧，安會(huì)蘋，程紅旭，王鳳華，靳洪濤,2*，魏金鋒,2*

(1.北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，北京 100176； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，北京 100050)

流式細(xì)胞儀(flow cytometer)主要應(yīng)用于生命科學(xué)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，如免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及微生物學(xué)等；在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，能輔助多種疾病診斷，尤其是白血病的診斷、分型和療效評(píng)定；在藥物安全性評(píng)價(jià)應(yīng)用中，主要用于免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的檢測(cè)，目前已經(jīng)成為這些領(lǐng)域研究不可缺少的基本儀器。GLP體系是新藥非臨床安全性評(píng)價(jià)的一套標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量規(guī)范，目的是保證數(shù)據(jù)的真實(shí)性、準(zhǔn)確性和可靠性。根據(jù)《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第34號(hào))的規(guī)定，研究機(jī)構(gòu)根據(jù)研究工作的需要配備相應(yīng)儀器設(shè)備，同時(shí)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相應(yīng)的儀器性能驗(yàn)證。由于儀器性能驗(yàn)證是新提出來的要求，目前在GLP體系下還沒有比較成熟的可參考方案，本研究以我國(guó)醫(yī)藥《YY/T 0588-2017流式細(xì)胞儀》[1]為依據(jù)，建立了流式細(xì)胞儀在GLP體系下性能驗(yàn)證的方法，主要解決GLP體系下流式細(xì)胞儀的驗(yàn)證問題，符合國(guó)內(nèi)國(guó)際最新的要求，為流式細(xì)胞儀整體性能評(píng)價(jià)提供可靠、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)SD大鼠雌雄各一只，雌性動(dòng)物體重205 g，雄性動(dòng)物體重261 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]，動(dòng)物飼養(yǎng)條件為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施持續(xù)保持屏障環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，主要環(huán)境指標(biāo)的控制范圍：室溫20℃～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，最小換氣次數(shù)15次/小時(shí)，光照明：暗=12 h：12 h。普通級(jí)Beagle犬雌雄各一只，雌性動(dòng)物體重7.8 kg，雄性動(dòng)物體重8.1 kg，購(gòu)自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0001]；食蟹猴雌性動(dòng)物體重3.3 kg，雄性動(dòng)物體重3.6 kg，購(gòu)自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司[SCXK(京)2015-0011]。Beagle犬和食蟹猴動(dòng)物飼養(yǎng)條件均為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施持續(xù)保持普通環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。主要環(huán)境指標(biāo)的控制范圍：室溫16℃～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，最小換氣次數(shù)8次/小時(shí)，光照明：暗=12 h：12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(京)2015-0021]。實(shí)驗(yàn)期間按動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

真空采血管購(gòu)自北京積水創(chuàng)格公司；EDTA-K2抗凝管、檸檬酸鈉抗凝管均購(gòu)自北京協(xié)順祥醫(yī)療科技有限公司。

流式細(xì)胞儀FACSVerseTM型，美國(guó)BD公司； T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒、APC Anti-Rat CD3/PE Anti-Rat CD4/FITC Anti-Rat CD8a、APC Anti-Dog Pan T Cell/PE Anti-Dog CD4/FITC Anti-Dog CD8、PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD3/FITC Mouse Anti-Human CD4/PE MouseAnti-Human CD8、BD FACSuiteTM標(biāo)準(zhǔn)微球(CS&T Research Beads)均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本采集

積水創(chuàng)格真空采血管，EDTA-K2抗凝管采血，用于前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)分辨率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，表面標(biāo)志物重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。檸檬酸鈉抗凝管采血，用于FSC和SSC分辨率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。采集的樣本需是無溶血、無凝血、無脂血的新鮮血樣本。

1.3.2 檢測(cè)項(xiàng)目

CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞共3個(gè)項(xiàng)目。

1.3.3 性能驗(yàn)證前準(zhǔn)備

在開展驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)前，每批檢測(cè)前需要對(duì)儀器進(jìn)行性能質(zhì)控(performance QC)測(cè)定，確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果在質(zhì)控范圍內(nèi)才可以進(jìn)行相應(yīng)的性能驗(yàn)證[2]。樣本處理要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行，如果出現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控失控或影響檢測(cè)結(jié)果的其它因素，需要棄去異常數(shù)據(jù)，重新進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)分辨率

(1)移液器吸取5 μL檸檬酸鈉抗凝Beagle犬雄性動(dòng)物全血，加入到裝有1 mL鞘液的試管中，充分混勻后上機(jī)檢測(cè)。

技術(shù)要求：檢查FSC和SSC圖，可以分開血小板和紅細(xì)胞[3-5]。

(2)移液器吸取100 μL EDTA-K2抗凝全血，溶解紅細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

技術(shù)要求：檢查FSC和SSC圖，可以分開外周血白細(xì)胞三群(包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)[3-5]。

1.3.5 表面標(biāo)志物重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

SD大鼠、Beagle犬和食蟹猴的動(dòng)物樣品，雌雄各一只，移液器吸取100 μL EDTA抗凝全血，加入已標(biāo)記好CD3+、CD4+、CD8+試劑，按照T淋巴細(xì)胞亞群樣品處理的SOP進(jìn)行樣品處理，樣品處理完成后進(jìn)行表面標(biāo)志物重復(fù)性的檢測(cè)[6]，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定10次，分別計(jì)算CD3+、CD4+、CD8+百分比結(jié)果的變異系數(shù)(CV)。

技術(shù)要求：陽(yáng)性百分比結(jié)果的變異系數(shù)應(yīng)符合：

(1)陽(yáng)性百分比大于等于30%時(shí)，CV值應(yīng)不大于8%。

(2)陽(yáng)性百分比小于30%時(shí)，CV值應(yīng)不大于15%。

圖1 前向角散射光和側(cè)向角散射光分辨率檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Test results of the resolution power on FSC and SSC

1.3.6 攜帶污染率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取適量CS&T Research Bead微球，用1 mL鞘液稀釋混勻后上機(jī)測(cè)試，連續(xù)測(cè)試3次，計(jì)算標(biāo)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別記為Hi-1、Hi-2、Hi-3。再進(jìn)行空白數(shù)量測(cè)試，連續(xù)測(cè)試3次，計(jì)算標(biāo)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別記為L(zhǎng)i-1、Li-2、Li-3。按照此操作循環(huán)3次，再計(jì)算攜帶污染率(Ci)，取最大值。

式中：Ci是第i次循環(huán)的攜帶污染率值，i=1～3。

技術(shù)要求：攜帶污染率應(yīng)不大于0.5%。

1.3.7 儀器穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將適量CS&T Research Bead標(biāo)準(zhǔn)微球，加入1 mL PBS充分混勻后上機(jī)進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試完成后，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度(FL1)；環(huán)境溫度變化不超過設(shè)定溫度的5%時(shí)，連續(xù)開機(jī)8 h后，在流式細(xì)胞儀的相同設(shè)置條件下重復(fù)步驟，得到標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度(FL2)，按公式計(jì)算FL1、FL2偏差值(B)[7-8]。

式中：

FL1∶0 h標(biāo)準(zhǔn)微球平均熒光強(qiáng)度值

FL2∶8 h后標(biāo)準(zhǔn)微球平均熒光強(qiáng)度值

技術(shù)要求：在8 h內(nèi)檢測(cè)FSC及所有熒光通道峰值平均熒光強(qiáng)度偏差值不超過±10%。

2 結(jié)果

2.1 FSC和SSC分辨率

FSC和SSC散點(diǎn)圖中，血小板和紅細(xì)胞可以分開，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞也可以分開，見圖1，同時(shí)均滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.2 表面標(biāo)志物重復(fù)性檢測(cè)

SD大鼠和Beagle犬動(dòng)物樣品表面標(biāo)志物CD3+、CD4+、CD8+百分比重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果[9-10]、CV見表1，表2，表3，從表中可以看出，各動(dòng)物樣品的重復(fù)性均滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.3 攜帶污染率

流式細(xì)胞儀3次檢測(cè)的攜帶污染率分別為0.06%，0.07%，0.09%，見表4均滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.4 儀器穩(wěn)定性

2.4.1 環(huán)境溫度

0 h條件下，環(huán)境溫度為22.5℃。8 h條件下環(huán)境溫度為22.0℃。

2.4.2 熒光峰值及偏差值

0 h和8 h檢測(cè)FSC及所有熒光通道的峰值平均熒光強(qiáng)度偏差值，見表5和圖2，均滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

表1 表面標(biāo)志物CD3+百分比重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

表2 表面標(biāo)志物CD4+百分比重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

2.5 評(píng)價(jià)與驗(yàn)證結(jié)論

2.5.1 評(píng)價(jià)

(1)本方法FSC和SSC散點(diǎn)圖可以分開粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，也可以分開紅細(xì)胞和血小板，分辨率符合方法要求。

(2)本方法表面標(biāo)志物CD3+、CD4+、CD8+百分比重復(fù)性檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)0.94%～4.09%，符合方法要求。

(3)本方法檢測(cè)的攜帶污染率分別為0.06%，0.07%，0.09%，符合方法要求。

(4)本方法檢測(cè)儀器穩(wěn)定性，熒光偏差值-2.40%～0.23%，符合方法要求。

2.5.2 結(jié)論

通過對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)的驗(yàn)證，確認(rèn)本實(shí)驗(yàn)室具備使用本方法開展檢測(cè)的能力。

表3 表面標(biāo)志物CD8+百分比重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

表4 流式細(xì)胞儀攜帶污染率

表5 FSC和各熒光通道0 h、8 h熒光峰值及偏差值

圖2 FSC和各熒光通道0 h、8 h熒光峰值直方圖Figure 2 FSC and histograms of fluorescence peaks at 0 h and 8 h in each fluorescent channel

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)的測(cè)定并不是新藥非臨床安全性評(píng)價(jià)中常規(guī)的項(xiàng)目，近年來，隨著免疫治療的增多，對(duì)于免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的測(cè)定項(xiàng)目不斷增多，需要較多應(yīng)用流式細(xì)胞儀，因此需要對(duì)它進(jìn)行性能驗(yàn)證。在GLP體系下，對(duì)流式細(xì)胞儀的性能驗(yàn)證，查閱文獻(xiàn)國(guó)內(nèi)外并沒有公認(rèn)的現(xiàn)行統(tǒng)一的方法。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在2017年12月5日發(fā)布、2018年12月1日實(shí)施醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YY/T 0588-2017流式細(xì)胞儀》，結(jié)合經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范原則(OECD SERIES ON PRINCIPLES OF GOOD LABORATORY PRACTICE，OECD GLP)和英國(guó)藥品和健康產(chǎn)品管理局(Medicines and Health care products Regulatory Agency, MHRA)對(duì)藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)要求[11-12]，性能驗(yàn)證涵蓋了儀器正常工作條件，儀器分辨率，樣品表面標(biāo)志物檢測(cè)重復(fù)性，攜帶污染率，儀器穩(wěn)定性等重要的性能指標(biāo)。

根據(jù)藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的樣本類型，在樣本的選擇上，采用SD大鼠、Beagle犬和食蟹猴的動(dòng)物樣品，建立適合在GLP體系下的流式細(xì)胞儀性能驗(yàn)證。在儀器的選擇上，本實(shí)驗(yàn)中BD FACSVerseTM流式細(xì)胞儀是專為科研應(yīng)用而設(shè)計(jì)的三激光八色流式細(xì)胞儀，光學(xué)設(shè)計(jì)可以將光在傳輸中的損失降到最低程度，為多色分析實(shí)驗(yàn)帶來高質(zhì)量的檢測(cè)靈敏度和分辨率，保證了檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。儀器操作人員通過規(guī)范化的培訓(xùn)，獲得儀器授權(quán)資格，以排除人為的影響因素。流式細(xì)胞儀的性能驗(yàn)證周期，一般情況下一年進(jìn)行一次。當(dāng)儀器移機(jī)或出現(xiàn)故障后需重新進(jìn)行性能驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后儀器才可以使用。

綜上所述，BD FACSVerseTM流式細(xì)胞儀檢測(cè)性能良好，F(xiàn)SC和SSC分辨率、重復(fù)性、攜帶污染率、儀器穩(wěn)定性均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YY/T 0588-2017流式細(xì)胞儀》中的技術(shù)要求。對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證有助于規(guī)范GLP實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理，提高流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果的可靠性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，為藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)的參考依據(jù)，本方法可以為國(guó)內(nèi)其他相關(guān)機(jī)構(gòu)流式細(xì)胞儀的性能驗(yàn)證提供可以借鑒的范式。