張靜,李罡,張欣,劉艷翠,鄭曉宇,孫平
1.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室,黑龍江牡丹江 157011;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院骨外一科,黑龍江牡丹江 157011;3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院超聲科,黑龍江牡丹江 157011;4.牡丹江醫(yī)學(xué)院2017 級(jí)影像9 班,黑龍江牡丹江 157011
2003 年,Al-Hajj 首次將人乳腺癌干細(xì)胞從乳腺癌組織中分離并鑒定出來(lái)[1],從此很多相關(guān)醫(yī)學(xué)研究均表明[2-4],在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中, 乳腺癌干細(xì)胞均發(fā)揮著極為重要的作用。 但是,目前,臨床還沒(méi)有弄清楚乳腺癌干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。 該研究探討了2019 年1—6 月TNF-α 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的干性及和分子機(jī)制, 現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。
應(yīng)用美國(guó)Hyclone 公司生產(chǎn)的RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基, 美國(guó)Gibco 公司生產(chǎn)的Opti-MEM、Gibco 血清,中國(guó)啟動(dòng)子生物有限公司生產(chǎn)的胰酶粉、NP-40 裂解液, 美國(guó)Invitrogen 公司生產(chǎn)的Lipo2000, 美國(guó)Sigma 公司生產(chǎn)的十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris Base、甘氨酸;細(xì)胞株及質(zhì)粒為T(mén)47D 細(xì)胞株、MCF-7 細(xì)胞株,分別隸屬于人乳腺癌細(xì)胞系, 同時(shí)應(yīng)用上海GENEPHARMA 公司生產(chǎn)的siNC、siEZH2;采用蘇州凈化設(shè)備公司生產(chǎn)的超凈工作臺(tái), 美國(guó)Thermo 公司生產(chǎn)的37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱, 德國(guó)Sigma 公司生產(chǎn)的臺(tái)式離心機(jī)、4℃高速離心機(jī),青島Haier 公司生產(chǎn)的-40℃低溫冰箱、-80℃超低溫冰箱等。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ①細(xì)胞復(fù)蘇。 將凍存管從-80℃冰箱中取出,以較快的速度在37℃水浴鍋中放置,盡可能快地融化,然后進(jìn)行5 min 的低速離心, 將速率設(shè)定為1 200 r/min,第3 天在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行觀察并換液;②細(xì)胞傳代培養(yǎng)(貼壁細(xì)胞)。 將舊培養(yǎng)液吸掉,用PBS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1 次洗滌, 將1.0 mL 0.25%胰蛋白酶加入,在
37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行15 s~30 min 的作用后在等量含血清的培養(yǎng)基中加入, 將消化作用終止。 用吸管對(duì)細(xì)胞進(jìn)行吹打,盡可能吹打其為單細(xì)胞懸液,將其中1/3 取出來(lái),向新的培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移培養(yǎng), 將培養(yǎng)基補(bǔ)足后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置繼續(xù)培養(yǎng);③細(xì)胞凍存。 在細(xì)胞具有良好的狀態(tài)的情況下凍存細(xì)胞,用胰酶消化貼壁細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行吹打,對(duì)其成團(tuán)的現(xiàn)象進(jìn)行有效避免,進(jìn)行5 min 的離心,將速率設(shè)定為1 000 r/min,將上清液吸掉。 將1 mL 細(xì)胞凍存液加入,標(biāo)記好。 用封口膜封口。 在4℃、-20℃、-80℃的溫度下分別冷凍30 min、2 h、24 h,長(zhǎng)期儲(chǔ)存在液氮罐中。
1.2.2 脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染細(xì)胞 用胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化,將消化終止后離心將培養(yǎng)液棄去,在六孔板中均勻接種3~5×105個(gè)細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行觀察,其達(dá)到60%左右后轉(zhuǎn)染。 將2 個(gè)無(wú)菌EP 管準(zhǔn)備出來(lái),體積為1.5 mL, 將100 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基加入到每個(gè)EP 管中,將6 μL 脂質(zhì)體Lipofectamin2000 加入其中一管中,將適量需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒加入到另外一管中,標(biāo)記好,以輕柔的動(dòng)作混勻,室溫下進(jìn)行5 min 的放置。在一個(gè)EP 管中加入另一個(gè)EP 管中的液體,以輕柔的動(dòng)作混勻,進(jìn)行20 min 的放置。 吸掉六孔板中的培養(yǎng)基,將PBS 加入對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1 次沖洗,將2.0 mL 無(wú)血清培養(yǎng)基加入,在六孔板中加入混合液,標(biāo)記好,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)。 4~6 h 后吸掉無(wú)血清培養(yǎng)基,將PBS 加入對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1 次沖洗,將2 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入,繼續(xù)進(jìn)行1~2 d 左右的培養(yǎng)后將細(xì)胞收起來(lái)。
1.2.3 腫瘤干細(xì)胞微球體形成實(shí)驗(yàn) 用DMEM/F12 培養(yǎng)基將干細(xì)胞培養(yǎng)基配制出來(lái),將4 mg/mL BSA+100 μg/mL A po-transferin+25 μg/mL Insulin+9.6 μg/mL Putrescin+4 μg/mL Heparin+10 μg/mL bFGF+20 μg/mL EGF 加入。 用1×PBS 對(duì)消化終止后的細(xì)胞進(jìn)行2 次洗滌,稀釋成單細(xì)胞懸液后在Corning 公司生產(chǎn)的低吸附六孔板中接種, 每孔1 000 個(gè)細(xì)胞, 進(jìn)行2 周的培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞球體個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),對(duì)細(xì)胞球體大小進(jìn)行測(cè)量。
1.2.4 CD44+/CD24- 干細(xì)胞群流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 培養(yǎng)細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 將0.25%胰蛋白酶加入對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化,待其從培養(yǎng)皿壁上脫落后將培養(yǎng)基加入將消化終止。 進(jìn)行5 min 的離心, 將速率設(shè)定為1 200 r/min, 將預(yù)冷的PBS 加入進(jìn)行2 次洗滌,平均分每管細(xì)胞為4 份,離心。將PBS 去掉, 將空白對(duì)照設(shè)定為其中1 管, 將PE-CD24 抗體、APC-CD44 抗體、PE-CD24 抗體+APC-CD44 抗體分別加入另外3 管, 室溫下進(jìn)行1 h 的避光孵育。 用預(yù)冷的PBS 進(jìn)行2 次洗滌,最后將200 μL PBS 加入,以輕柔的動(dòng)作混勻后上機(jī)檢測(cè)。
1.2.5 Western blot 提取細(xì)胞總蛋白,運(yùn)用BCA 法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定,制膠,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉,曝光,洗脫。
1.2.6 EZH2 mRNA 表達(dá)水平Real-Time PCR 檢 測(cè) 運(yùn)用Trizol 法將細(xì)胞內(nèi)總RNA 提取出來(lái), 向cDNA 逆轉(zhuǎn)錄,Real-Time PCR,Primer 引物依據(jù)GenBank 將人GAPDH堿基序列、EZH2 基因獲取過(guò)來(lái),采用Primer 5.0 軟件對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì),GAPDH、EZH2 上游引物分別為5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’、5’-AATCAGAGTACATGCGACTGAGA-3’,下游引物分別為5’-AGTCTTCTGGGT GGCAGTGAT -3’、5’ -GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC -3’。反應(yīng)體系為10 μL 2×SYBR Green+1 μL cDNA+2 μL 上有引物(10 μM)+2 μL 下游引物(10 μM)+5 μlLddH2O=20 μl/管,在ABI7300 反應(yīng)系統(tǒng)中放置樣品,在95℃的溫度下進(jìn)行20 s 的預(yù)變性, 在94℃的溫度下進(jìn)行3 s 的變性,在60℃的溫度下進(jìn)行30 s 的退火、延伸,共40 個(gè)循環(huán)。 對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析, 依據(jù)Ct 值將各組對(duì)樣品中目的基因進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算出來(lái)。
應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 計(jì)量資料用(x±s)表示,組間比較行t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
TNF-α 刺激組T47D 細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞分別為(3.86±0.64)%、(14.56±1.74)%, 空白對(duì)照組T47D 細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞分別為(0.46±0.10)%、(9.46±1.80)%。 TNF-α 刺激組患者的T47D 細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞干細(xì)胞比例均顯著高于空白對(duì)照組(t=4.303、6.965,P<0.05)。 見(jiàn)表1。
表1 乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞(CD44+/CD24-)比例受到TNF-α 的影響[(x±s),%]Table 1 The proportion of breast cancer cell stem cells (CD44+/CD24-) affected by TNF-α[(x±s),%]
TNF-α 刺激組患者的T47D 細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞EZH2 mRNA 水 平 均 顯 著 高 于 空 白 對(duì) 照 組 (t=3.182,2.776,P<0.05)。 見(jiàn)表2。
表2 乳腺癌細(xì)胞中EZH2 mRNA 水平受到TNF-α 的影響(x±s)Table 2 EZH2 mRNA levels in breast cancer cells affected by TNF-α(x±s)
TNF-α+siNC 組、Untreated 組 患 者 的T47D 細(xì) 胞、MCF-7 細(xì)胞成球能力均顯著高于TNF-α+siEZH2 組 (P<0.05), 而Untreated 組 患 者 的 成 球 能 力 又 均 顯 著 高 于TNF-α+siEZH2 組(P<0.05)。 見(jiàn)表3。
表3 EZH2 表達(dá)下調(diào)后乳腺癌細(xì)胞成球能力受到TNF-α 的影響(x±s)Table 3 The ability of breast cancer cells to become globular after down-regulation of EZH2 affected by TNF-α (x±s)
TNF-α+siNC 組、Untreated 組 患 者 的T47D 細(xì) 胞、MCF-7 細(xì)胞CD44+/CD24-細(xì)胞比例均顯著高于TNF-α+siEZH2 組 (P <0.05), 而Untreated 組 患 者 的CD44+/CD24-細(xì)胞比例又均顯著高于TNF-α+siEZH2 組 (P<0.05)。 見(jiàn)表4。
表4 EZH2 表達(dá)下調(diào)后乳腺癌細(xì)胞中干細(xì)胞比例受到TNF-α 的影響[(x±s),%]Table 4 The proportion of stem cells in breast cancer cells after down-regulation of EZH2 affected by TNF-α[(x±s),%]
乳腺是由皮膚,纖維組織,腺體和脂肪組成的。 乳腺癌是指發(fā)生在乳腺腺上皮組織上的惡性腫瘤,99%的乳腺癌發(fā)生在女性,男性約占1%。 近年來(lái),我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。 乳腺癌的病因尚未完全清楚,它的危險(xiǎn)因素有乳腺癌家族史、月經(jīng)初潮早或者絕經(jīng)晚、未婚未育及晚育、長(zhǎng)期飲酒、肥胖等。 癥狀方面,乳腺癌主要表現(xiàn)為乳房腫塊,乳頭下陷,乳頭溢液,一般為血性溢液,以及皮膚的改變,最常見(jiàn)的是橘皮樣改變。 另外,晚期的乳腺癌可以出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及肺部、骨、腦及肝臟等遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移。 乳腺癌的患者可在乳腺處可摸到包塊,并且位置比較深,表面不光滑,質(zhì)地較硬,活動(dòng)度不是特別好。 其次乳頭凹陷,也是乳腺癌代表性的特點(diǎn)。 另外乳頭溢液、溢血液或黃色的液體、 乳腺的皮膚出現(xiàn)橘皮樣的改變也都是乳腺癌的癥狀。 乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,乳腺是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的。 目前乳腺癌的治療比較規(guī)范,屬于綜合性的治療,應(yīng)當(dāng)根據(jù)腫瘤的分期和患者的身體狀況,酌情采用手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療,還有基因靶向治療及中醫(yī)藥輔助治療等多種手段,首選是手術(shù)治療。 TNF-α 是腫瘤壞死因子,它可以促進(jìn)T 細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子, 進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[5],腫瘤干細(xì)胞和炎性腫瘤微環(huán)境的關(guān)系極為密切。 在腫瘤微環(huán)境炎癥因子中,TNF-α 占有重要地位,其分泌主體為巨噬細(xì)胞。 很多相關(guān)醫(yī)學(xué)研究均表明[6-8],TNF-α 對(duì)腫瘤進(jìn)展中很多重要過(guò)程進(jìn)行介導(dǎo)。 在TNF-α 下游信號(hào)通路中,AKT 信號(hào)占有重要地位,其在細(xì)胞凋亡、分化等中參與,能夠?qū)ZH2 的表達(dá)激活,對(duì)結(jié)腸癌上皮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生。同時(shí), 還能夠?qū)Φ蛲鲞^(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子進(jìn)行直接磷酸化,對(duì)凋亡進(jìn)行抵抗[9]。 張國(guó)強(qiáng)等[10]相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明,TNF-α 能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自我更新能力的增強(qiáng), 途徑為 將AKT 信 號(hào) 通 路 活 化, 將EZH2 表 達(dá) 上 調(diào) [(5.20±1.35)%→(8.12±1.63)%]。 該研究結(jié)果表明, TNF-α 刺激組T47D 細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞分別為 (3.86±0.64)%、(14.56±1.74)%, 空 白 對(duì) 照 組T47D 細(xì) 胞、MCF-7 細(xì) 胞 分 別 為(0.46±0.10)%、(9.46±1.80)%。 TNF-α 刺激組患者的T47D細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞干細(xì)胞比例均顯著高于空白對(duì)照組(t=4.303、6.965,P<0.05)。 TNF-α 刺激組患者的T47D 細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞EZH2 mRNA 水平均顯著高于空白對(duì)照組(t=3.182、2.776,P<0.05)。TNF-α+siNC 組、Untreated 組患者的T47D 細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞成球能力均顯著高于TNF-α+siEZH2 組(P<0.05),而Untreated 組患者的成球能力又均顯著高于TNF-α+siEZH2 組 (P<0.05)。 TNF-α+siNC 組、Untreated 組 患 者 的T47D 細(xì) 胞、MCF-7 細(xì) 胞CD44+/CD24-細(xì)胞比例均顯著高于TNF-α+siEZH2 組(P<0.05),而Untreated 組患者的CD44+/CD24-細(xì)胞比例又均顯著高于TNF-α+siEZH2 組(P<0.05),和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。
綜上所述,TNF-α 通過(guò)將AKT 信號(hào)通路活化,將EZH2 表達(dá)上調(diào),促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自我更新能力的增強(qiáng)。