陸景潤，肖 斌，鄧 淳，李緯瑋，李林海，黃 健，張 姝

0 引 言

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是最常見的女性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅女性的健康和生命[1-3]。隨著手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療等治療策略的不斷完善及多模態(tài)成像設(shè)備的應(yīng)用，乳腺癌的治療療效得到了極大的改善[4-5]。然而，乳腺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍不能得到有效的控制，是乳腺癌患者死亡的主要原因[6]。此外，目前臨床上尚缺乏診斷乳腺癌的特異性標(biāo)志物。因此，尋找乳腺癌診斷和預(yù)后評估的標(biāo)志物，以明確診斷乳腺癌并根據(jù)預(yù)后監(jiān)測指導(dǎo)全程最佳治療達(dá)到減少復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的目的具有重要的研究意義。

CBL(又稱c-CBL或CBL2)基因位于人類染色體11q23.3上，其編碼的CBL蛋白是Casitas B系淋巴瘤(Casitas B-lineage Lymphoma，CBL)蛋白家族的一員，是一種具有RING(Really Interesting New Gene)指結(jié)構(gòu)域的E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶[7-8]。CBL作為酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控因子[9-13]，有報道稱CBL蛋白通過其E3活性參與下游受體酪氨酸激酶的負(fù)調(diào)控。同時，其表達(dá)水平受miRNA等分子的上游調(diào)控，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及治療中發(fā)揮重要作用，但CBL在乳腺癌組織中的表達(dá)水平及其在不同類型的乳腺癌中的表達(dá)情況，以及在乳腺癌患者診斷和預(yù)后評估中的作用鮮有報道。本研究旨在分析CBL在乳腺癌組織中的表達(dá)水平及其在不同類型乳腺癌組織中的表達(dá)差異，并探討CBL在乳腺癌診斷及評估乳腺癌患者臨床預(yù)后中的作用，為將CBL作為乳腺癌診斷、分型分期的輔助標(biāo)準(zhǔn)以及評估預(yù)后的分子指標(biāo)提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)及材料從USCS Xena(https://xenabrowser.net)數(shù)據(jù)庫下載1217個乳腺組織樣本的測序數(shù)據(jù)，其中包括CBL基因表達(dá)譜矩陣、樣本臨床信息和生存信息。IHC實驗的主要儀器和試劑：烤箱購自中國上?；厶﹥x器制造有限公司；組化筆購自Gene tech公司；顯微鏡購自CIC公司；組織芯片掃描儀購買自3D HISTECH公司；脫色搖床、EDTA(pH9.0)抗原修復(fù)液、PBS緩沖液、3%雙氧水、BSA、蘇木精染液、蘇木精分化液、蘇木精返藍(lán)液、中性樹膠、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體、組化試劑盒DAB顯色劑購自中國武漢塞維爾生物科技有限公司；無水乙醇、二甲苯購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；兔抗人CBL多克隆抗體購自美國Bioworld公司；組織芯片由中國上海芯超生物科技有限公司提供，包括乳腺癌組織和癌旁組織。

1.2方法

1.2.1CBL基因在乳腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)分析下載的樣本包括乳腺癌組織(n=1104)和癌旁組織(n=113)，檢驗兩樣本中CBL基因的表達(dá)差異。從乳腺癌分子分型、病理類型等方面分析CBL基因的表達(dá)情況。根據(jù)下載的臨床信息中乳腺癌組織雌激素受體、孕激素受體、人類表皮生長因子受體2的狀態(tài)將乳腺癌樣本分為Luminal A(n=424)、Luminal B(n=135)、HER2+(n=37)和TNBC(n=111)。分析比較CBL基因的差異表達(dá)。按照乳腺癌組織病理類型分成乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(n=882)、乳腺浸潤性小葉癌(n=211)、混合型組織(n=39)、黏液性癌(n=18)、其他(n=47)，比較CBL在5種不同病理類型乳腺癌樣本中的表達(dá)。

1.2.2CBL基因表達(dá)與乳腺癌TNM分級及臨床分期的相關(guān)性分析根據(jù)腫瘤體積和臨近組織受累范圍，將乳腺癌樣本分為T1(n=310)、T2(n=706)、T3(n=150)、T4(n=47)、TX(n=3)；根據(jù)區(qū)域淋巴結(jié)受累情況分為N0(n=563)、N1(n=416)、N2(n=132)、N3(n=82)、NX(n=23)；根據(jù)是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為cM0 (i+)(n=7)、M0(n=1014)、M1(n=24)、MX(n=171)。按照不同臨床分期分為Ι期(n=202)、Ⅱ期(n=693)、Ⅲ期(n=275)、Ⅳ期(n=22)、其他(n=12)。比較CBL在乳腺癌不同TNM分級和臨床分期間的表達(dá)，判斷CBL基因表達(dá)與乳腺癌不同TNM分級及臨床分期間是否存在相關(guān)性。

1.2.3Kaplan-Meier(KM)生存曲線分析共有1203例乳腺癌樣本具有臨床預(yù)后信息和CBL基因表達(dá)信息，根據(jù)基因表達(dá)值的中位數(shù)2.152分為高表達(dá)組(≥2.152)和低表達(dá)組(<2.152)，分析CBL表達(dá)水平對患者預(yù)后的影響，判斷CBL基因是否為乳腺癌預(yù)后相關(guān)基因。

1.2.4采用IHC法檢測乳腺癌組織與癌旁組織中CBL蛋白表達(dá)選取了包含有乳腺癌患者癌組織和癌旁組織的組織芯片(HBre-Duc060CS-04)進(jìn)行免疫組化染色實驗。組織芯片于烤箱烘烤1 h后，脫蠟，梯度水化；置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH9.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS(pH7.4)洗滌3次；放入3%雙氧水溶液中室溫避光孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS(pH7.4)洗滌3次；3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；在芯片上滴加CBL蛋白抗體(1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS(pH7.4)洗滌3次；滴加HRP標(biāo)記二抗(1∶200稀釋)，室溫孵育50 min，PBS(pH7.4)洗滌3次；DAB顯色液，蘇木精復(fù)染；流水沖洗蘇木精返藍(lán)液后梯度脫水，中性樹膠封固；采用組織芯片掃描儀將組織切片上所有的組織信息掃描成像，形成文件。應(yīng)用Quant center中的densito quant軟件自動識別，并設(shè)置組織切片上所有的深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。進(jìn)而對每個組織點進(jìn)行識別分析出強陽性、中度陽性、弱陽性及陰性的面積(單位：像素)和陽性的百分比，最后進(jìn)行H-score的評分；分析乳腺癌組織與癌旁組織免疫組化染色評分結(jié)果，判斷2組樣本中CBL蛋白的表達(dá)差異。

2 結(jié) 果

2.1CBL基因在乳腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)乳腺癌組織CBL基因表達(dá)(2.15±0.64)較癌旁組織(2.65±0.38)下調(diào)(P<0.05)。4種分子分型乳腺癌組織中的CBL表達(dá)量較癌旁組織明顯降低(P<0.05)；在不同分子分型的乳腺癌中，三陰性型乳腺癌組織中CBL基因的表達(dá)量最高(P<0.05)；Luminal B型乳腺癌組織CBL基因的表達(dá)量較Luminal A型降低(P<0.05)。在不同病理類型的乳腺癌樣本中，浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌以及黏液性癌組織中CBL基因的表達(dá)水平較混合型組織乳腺癌降低(P<0.05)，浸潤性導(dǎo)管癌中CBL基因的表達(dá)水平高于浸潤性小葉癌(P<0.05)。見表1。表明CBL可能成為乳腺癌分類診斷的輔助分子標(biāo)志物。

分類nCBL基因的表達(dá)分子分型 三陰性型1112.393±0.531? HER2+型372.056±0.715?# Luminal A型4242.239±0.485?# Luminal B型1352.132±0.500?#△ 癌旁組織1132.653±0.380病理類型 浸潤性導(dǎo)管癌8822.210±0.531▲ 浸潤性小葉癌2112.129±0.650▲☆ 混合型組織乳腺癌392.521±0.550 黏液性癌182.134±0.310▲ 其他472.219±0.548

與癌旁組織比較，*P<0.05；與三陰性型比較，#P<0.05；與Luminal A型比較，△P<0.05；與混合型組織乳腺癌比較，▲P<0.05；與浸潤性導(dǎo)管癌比較，☆P<0.05

2.2CBL基因表達(dá)與乳腺癌TNM分級及臨床分期的相關(guān)性

2.2.1CBL基因表達(dá)與乳腺癌TNM分級的相關(guān)性T1至T3CBL基因的表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)，說明CBL基因的表達(dá)變化可能與乳腺癌T1、T2、T3分級相關(guān)，并且與腫瘤體積和臨近組織受累范圍相關(guān)。N0中CBL基因的表達(dá)量較N1升高(P<0.05)，說明CBL基因的表達(dá)量可能與乳腺癌由N0期向N1期的發(fā)展相關(guān)。在cM0 (i+)、M0、M1中CBL基因表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明CBL基因的表達(dá)量可能與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表2。

2.2.2CBL基因表達(dá)與乳腺癌臨床分期的相關(guān)性Ι期至Ⅲ期CBL基因的表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)。表明CBL基因的表達(dá)水平可能與乳腺癌的臨床分期Ι期、Ⅱ期、Ⅲ期相關(guān)，并且隨著癌癥的發(fā)展逐漸降低，但是與Ⅳ期分期無關(guān)。見表2。

分期nCBL基因的表達(dá)譜矩陣T分期 T13102.225±0.497 T27062.149±0.660? T31502.019±0.491?# T4472.138±0.515 Tx32.224±0.249N分期 N05632.195±0.533 N14162.148±0.620△ N21322.166±0.532 N3822.093±0.485 Nx231.895±0.573M分期 cM0(i+)72.196±0.309 M010142.187±0.610 M1242.058±0.500 Mx1711.969±0.613臨床分期 Ⅰ期2022.228±0.5223 Ⅱ期6932.163±0.650▲ Ⅲ期2752.103±0.590▲☆ Ⅳ期222.044±0.523 其他122.210±0.388

與T1比較，*P<0.05；與T2比較，#P<0.05；與N0比較，△P<0.05；與Ⅰ期比較，▲P<0.05；與Ⅱ期比較，☆P<0.05

2.3ROC曲線評估CBL基因的診斷效能乳腺癌組織中CBL mRNA診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.768，說明CBL在乳腺癌的臨床診斷中具有較高的價值。見圖1。

圖 1 CBL mRNA診斷乳腺癌的 ROC 曲線

Figure1ROCcurveofCBLmRNAindiagnosisofbreastcancer

2.4乳腺癌患者預(yù)后生存分析生存分析結(jié)果顯示：與CBL基因低表達(dá)組相比，CBL基因高表達(dá)組生存率相對較高。log-rank檢驗結(jié)果顯示：CBL基因為預(yù)后相關(guān)基因，高表達(dá)CBL與乳腺癌患者的預(yù)后良好呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖2。

圖 2 CBL高低表達(dá)生存曲線

Figure2SurvivalcurveofCBLhighandlowexpression

2.5CBL蛋白在乳腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與癌旁組織CBL蛋白表達(dá)(150.87±33.41)相比，乳腺癌組織(106.48±37.59)表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖 3 代表性腫瘤組織及其臨近正常組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果( ×20)

Figure3Immunohistochemicalstainingresultsofrepresentativetumortissuesandtheiradjacentnormaltissues(×20)

3 討 論

E3泛素-蛋白連接酶CBL能夠催化泛素分子從泛素偶聯(lián)酶(E2)向特定底物的轉(zhuǎn)移，該蛋白的N-末端磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與多種酪氨酸磷酸化底物相互作用并靶向底物進(jìn)行降解，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在乳腺癌中，CBL在不同調(diào)控機制中發(fā)揮的作用也不同，甚至相反。有報道稱，CBL可介導(dǎo)EGFR泛素化降解增多而使乳腺腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移受到抑制[14]，同時在乳腺癌曲妥珠單抗靶向治療中也發(fā)揮積極的作用[15-16]。相反，CBL可通過抑制TGF-β信號傳導(dǎo)的腫瘤抑制活性來增強乳腺腫瘤形成[17]；miR-124-3p通過直接結(jié)合CBL的3'-UTR負(fù)調(diào)控CBL的表達(dá)，而過表達(dá)CBL能夠減弱miR-124-3p對乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用[18]。此外，在乳腺癌抗雌激素治療中，CBL通過下調(diào)c-Src的表達(dá)和抑制他莫昔芬誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和AKT活性使MCF-7細(xì)胞對TAM敏感[19]；CBL還通過抑制ER-c-Src-HER2復(fù)合物的形成來逆轉(zhuǎn)HER2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞對TAM的耐藥性[20]。在其他癌癥中，如肺癌、骨肉瘤等，CBL起到抑制的作用[21-22]。

本研究通過數(shù)據(jù)庫挖掘結(jié)合組織芯片分析，闡明了CBL在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，揭示了CBL mRNA的表達(dá)與乳腺癌分子分型、TNM分級、臨床分期、病理分型和預(yù)后的相關(guān)性。與癌旁組織相比，CBL mRNA及蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯下調(diào)。以病理學(xué)診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)繪制ROC曲線，結(jié)果顯示CBL mRNA水平診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.768，在乳腺癌診斷中具有較高的價值。同時，生存分析顯示：CBL基因為預(yù)后相關(guān)基因，高表達(dá)CBL mRNA與乳腺癌患者的預(yù)后良好呈正相關(guān)(P<0.05)。另外，通過數(shù)據(jù)庫資料分析還發(fā)現(xiàn)，CBL mRNA在不同分子分型、病理類型、TNM分級和臨床分期的乳腺癌組織中的表達(dá)量有差異，并且CBL mRNA的表達(dá)量與乳腺癌T1、T2、T3之間分級，N0、N1之間分級，Ι期、Ⅱ期、Ⅲ期之間分期有相關(guān)性，此外，CBL在乳腺癌的TNM分級各級及其在臨床分期各期中的表達(dá)情況存在相似性，即在一定范圍內(nèi)，隨著癌癥的進(jìn)展，由T1至T3、N0至N1、Ι期至Ⅲ期，CBL mRNA的表達(dá)水平逐漸降低，但其表達(dá)水平可能與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。AJCC癌癥分期手冊規(guī)定當(dāng)乳腺癌發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移時(T1-4N0-3M1)即為臨床分期Ⅳ期，而我們的實驗結(jié)果顯示，CBL基因的表達(dá)量可能與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期Ⅳ期無關(guān)，這與AJCC癌癥分期手冊的規(guī)定相符。進(jìn)一步驗證了CBL作為乳腺癌分類診斷標(biāo)志物的可能性。

有文獻(xiàn)報道，EGFR的過表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、惡性程度和預(yù)后差相關(guān)[23-24], 而在EGFR的調(diào)節(jié)過程中，CBL可介導(dǎo)EGFR泛素化降解增多而對乳腺癌起抑制作用[14]。結(jié)合本研究結(jié)果，我們提出CBL可能是乳腺癌中的潛在的抑癌基因。同時，這從一方面對本研究的結(jié)果：隨著癌癥的進(jìn)展，CBL的表達(dá)水平逐漸降低，進(jìn)行解釋。本研究結(jié)果還指出：高表達(dá)CBL與乳腺癌患者的預(yù)后良好呈正相關(guān)，這與已報道的CBL在肺癌患者預(yù)后評估中的作用一致[21]。

綜上所述，本研究為CBL作為乳腺癌診斷、分型分期的輔助標(biāo)準(zhǔn)以及評估預(yù)后的分子指標(biāo)提供了可靠的理論參考。CBL作為E3泛素-蛋白連接酶，我們接下來的研究將從篩選CBL蛋白的相互作用底物入手，從全新的角度進(jìn)一步研究闡明乳腺癌的發(fā)病機制及CBL在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。