賀舟，常青，唐成林，朱正威

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，重慶市 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)體育醫(yī)學(xué)院，重慶市 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市 400016

骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)員在運(yùn)動(dòng)、訓(xùn)練中最為常見的運(yùn)動(dòng)損傷，其中又以急性骨骼肌鈍挫傷較為常見[1]。我國(guó)運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練過程中肌肉挫傷的概率達(dá)50%～70%[2]；高校體育運(yùn)動(dòng)損傷中輕度損傷占14.53%，中度損傷占60.66%[3]。骨骼肌損傷治療通常在損傷24 h后才開始介入，在損傷后24 h 內(nèi)缺乏有效治療措施。本研究探索骨骼肌損傷24 h 內(nèi)介入治療對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

8 周齡SPF 級(jí)健康成年雄性Sprague‐Dawley 大鼠40 只，體質(zhì)量(200±20) g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK 渝2018‐0003。實(shí)驗(yàn)過程中所有動(dòng)物相關(guān)的處理嚴(yán)格按照國(guó)際動(dòng)物倫理準(zhǔn)則和使用指南的相關(guān)規(guī)定。分籠飼養(yǎng)，每籠4 只，室溫(21±2)℃，相對(duì)濕度65%～75%，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自然光照。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)抽樣法分為A、B、C、D、E共5組，每組8只。

1.2 主要試劑及儀器

磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated mito‐gen‐activated protein kinase,p‐MAPK)一抗、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶(phosphorylated mitogen‐acti‐vated protein kinase kinase,p‐MEK)一抗、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases p‐ERK)1/2 一抗、胰島素樣生長(zhǎng)因子‐1(insulin‐like growth factor‐1,IGF‐1)一抗：重慶茂縉生物技術(shù)有限公司。Western blotting 試劑：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。mmobilonTMWestern Chemilumi‐nescent HRP Substrate 發(fā) 光 液：美 國(guó)MILLIPORE 公司。Trizol 總RNA 提取液、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、RR037A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物合成：日本TAKARA 公司。AL204 型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO 公司。電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、T100TM聚合酶鏈反應(yīng)(poly‐merase chain reaction,PCR)儀和CFX ConnectTM熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)：美國(guó)BIO‐RAD 公司。低溫離心機(jī)：日本SIGMA 公司。凝膠圖像掃描及分析系統(tǒng)：北京賽智科技公司。ThermoND2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀：上海GENE 公司。DP73 拍攝裝置：日本OLYM‐PUS 公司。自制動(dòng)物模型打擊裝置：上方為直徑22 mm、長(zhǎng)250 mm 鋁管，下方為直徑12 mm、長(zhǎng)100 mm 鋁管，里面套有直徑10 mm、長(zhǎng)150 mm 木棍。圖像采集系統(tǒng)等由重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院提供。

1.3 動(dòng)物模型制備與評(píng)價(jià)

B～E 組參照楊輝等[4]的方法造模并進(jìn)行改良。打擊裝置的木棍緊貼大鼠右小腿內(nèi)側(cè)面(其下為腓腸肌中段)，將直徑20 mm、長(zhǎng)170 mm、質(zhì)量640 g的實(shí)心鋼柱體從高250 mm 處下落，打擊套在下方空心鋁管中的木棍，造成腓腸肌急性挫傷模型。實(shí)心鋼柱體的投放和大鼠的固定均由專人操作。造模后觀察大鼠行走跛行且造模側(cè)有明顯腫脹，為造模成功。

1.4 干預(yù)方法

C組和E組于造模后24 h內(nèi)介入按摩，專人操作。大鼠側(cè)臥位固定，套頭套，待其情緒穩(wěn)定后用拇指揉法按摩傷處，以按摩部位肌肉下陷且大鼠保持安靜狀態(tài)的刺激量為準(zhǔn)，否則停止按摩，待其安靜后繼續(xù)治療；按摩手法應(yīng)緩和、均勻且持久，約120～140 次/min[5]，持續(xù)10 min。B 組僅套頭套，不予任何干預(yù)。D 組和E 組于造模后24 h 內(nèi)參照高尚等[6]的訓(xùn)練方案介入跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練1次，速度13 m/min，持續(xù)20 min。見表1。

1.5 取材

造模后24 h，大鼠以4%水合氯醛0.8 ml/kg 腹腔注射麻醉，右腿保持造模時(shí)姿勢(shì)，于坐骨結(jié)節(jié)處用齒鑷提起皮膚，圓剪切皮膚至跟腱處，分離皮膚和其他肌肉組織，在跟腱處剪斷跟腱并翻折180°，除去比目魚肌，剪下完整腓腸肌，0.9%氯化鈉溶液沖洗。迅速放入液氮罐中速凍，-80 ℃冰箱儲(chǔ)存，分別用于West‐ern blotting 檢測(cè)和PCR 檢測(cè)。部分組織4%多聚甲醛固定包埋，用于HE染色。

1.6 HE染色

腓腸肌組織4%多聚甲醛固定48～72 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚5 μm；二甲苯脫蠟，蒸餾水水化，蘇木精染色，1%鹽酸‐乙醇分化，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，400倍光鏡下觀察。

1.7 Western blotting

各只大鼠取30～50 mg 組織，剪碎后加入適量蛋白裂解液蛋白酶抑制劑勻漿后配平，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清；ABC 法蛋白定量，95 ℃10 min 變性；SDS‐PAGE 恒壓電泳，移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，TBST 洗膜，分別加p‐MAPK(1 ∶500)、p‐MEK(1 ∶1000)、p‐ERK1/2 (1∶1000)和GAPDH (1∶5000)一抗孵育，4 ℃搖床過夜；TBST洗膜，加入5%脫脂奶粉稀釋的二抗，搖床常溫反應(yīng)1 h，TBST 洗膜，加入發(fā)光液TCL 顯色，3 min后凝膠成像系統(tǒng)成像。Image J 軟件定量分析，GAP‐DH 作內(nèi)參，以目的條帶光密度值和內(nèi)參條帶光密度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 PCR

取腓腸肌組織50 mg 剪碎，移入1.5 ml無酶EP 管中，加Trizol 試劑1 ml 勻漿，提取總RNA。取總RNA 2 μl 稀釋50 倍，紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm/280 nm 處光密度值比值。加樣完全后，充分混勻，簡(jiǎn)短離心；參照ReverTre Ace‐α‐反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行c‐DNA 制備，并行PCR 反應(yīng)；取PCR 產(chǎn)物15 μl 加入上樣孔，5 V/cm 電泳(事先制備好瓊脂糖凝膠)，凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One 計(jì)算熒光值；結(jié)果以MyoD1/β‐actin和MyoG/β‐actin的比值表示。

引物序列如下[1]。

MyoD1：上游5'‐CGC CTG AGC AAA GTG AAC GA‐3'；下 游5'‐CAG ACC TTC AAT GTA GCG GAT G‐3'。

MyoG：上 游5'‐CCA GAC TAC CCA CCG TCC ATT‐3'；下游5'‐CTG AGT TTG CCC CGT TGA GG‐3'。

β‐actin：上游5'‐ACC CCG TGC TGC TGA CCG AG‐3'；下游5'‐TCC CGG CCA GCC AGG TCC A‐3'。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用()表示，組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD法分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

A 組腓腸肌纖維大小一致，呈多邊形，排列整齊，細(xì)胞核分布于肌細(xì)胞邊緣，顏色及形態(tài)均正常；B 組肌纖維腫脹、碎解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列紊亂。C～E 組較B 組肌纖維腫脹好轉(zhuǎn)，細(xì)胞排列整齊，但各干預(yù)組鏡下表現(xiàn)無明顯差別，均呈細(xì)胞腫脹，少量細(xì)胞破裂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅細(xì)胞聚集。見圖1。

2.2 Western blotting

C～E 組p‐MAPK、p‐MEK 和p‐ERK1/2 蛋白表達(dá)大多較A 組和B 組升高(P＜0.05)，其中D 組最高；A組IGF‐1 高于其他各組(P＜0.05)，C～E 組中，D 組最低。見圖2、表1。

2.3 PCR

B～E 組MyoD1 mRNA 表達(dá)水平均較A組升高(P＜0.05)，且C～E 組較B 組升高(P＜0.05)；C～E 組中，C 組最高，D 組次之，E 組最低。B～E 組MyoG mRNA 表達(dá)水平均較A 組升高(P＜0.05)，但C～E組較B 組降低(P＜0.05)；C～E 組中，E 組最高，D 組次之，C組最低(P＜0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠腓腸肌(HE染色，bar=50 μm)

圖2 各組腓腸肌IGF-1、p-MAPK、p-MEK和p-ERK1/2的Western blotting

3 討論

骨骼肌損傷在運(yùn)動(dòng)員比賽或訓(xùn)練中十分常見，自然恢復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，且不一定能完全恢復(fù)。目前治療主要建議患者采用常規(guī)治療方法簡(jiǎn)稱RICE 原則，即休息(rest)、冰敷(ice)、壓迫(compression)、抬高(eleva‐sion)，以減輕損傷部位早期腫脹[7]。治療后瘢痕修復(fù)較為普遍，修復(fù)部位運(yùn)動(dòng)能力下降，再損傷概率達(dá)44%[8]。有研究建議代之以POLICE 原則，即用保護(hù)(protest)和適當(dāng)負(fù)重(optimal loading)代替休息[9‐11]，強(qiáng)調(diào)在骨骼肌損傷后早期應(yīng)給予適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，促進(jìn)骨骼肌恢復(fù)。骨骼肌損傷在一定程度下，具有再生修復(fù)的能力[12]。如何更快更好地促進(jìn)受損骨骼肌愈合，是目前運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

骨骼肌損傷后的修復(fù)過程極其復(fù)雜，可人為劃分為沒有明顯時(shí)間界限的3 個(gè)階段，即炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)、組織塑形[5,13‐14]，涉及多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的共同調(diào)節(jié)[15‐16]。修復(fù)過程中除依靠?jī)?nèi)源性肌衛(wèi)星細(xì)胞外，還必須有生長(zhǎng)因子和適當(dāng)?shù)拇碳17‐18]，其中IGF‐1 在骨骼肌損傷修復(fù)中起重要作用[19]。肌肉受運(yùn)動(dòng)或外界刺激時(shí)，IGF‐1 表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)局部組織蛋白質(zhì)合成，防止細(xì)胞凋亡。IGF‐1 主要通過激活MAPK/MEK/ERK1/2 信號(hào)通路調(diào)控骨骼肌損傷修復(fù)[20‐21]。IGF‐1可促進(jìn)肌細(xì)胞增殖和骨骼肌質(zhì)量增加[5]。Hill 等[16]發(fā)現(xiàn)，骨骼肌損傷后IGF‐1 mRNA 表達(dá)顯著增加。IGF‐1 對(duì)肌細(xì)胞的有絲分裂作用主要由MAPK通路途徑介導(dǎo)[22]。MAPK 途徑與細(xì)胞增殖、分化、代謝等生理活動(dòng)密切相關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)至少3 種激酶，涉及4 種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中MAPK/ERK 通路也稱Ras‐Raf‐MEK‐ERK 通路，通過接受細(xì)胞表面受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[23]。生理?xiàng)l件下，為了維持細(xì)胞生長(zhǎng)和體內(nèi)平衡，體內(nèi)多個(gè)反饋機(jī)制參與調(diào)節(jié)這一信號(hào)通路的活性。當(dāng)上游受體被激活時(shí)，Ras 被激活，隨后活化 的Raf 將MEK 磷 酸 化，p‐MEK 又將ERK 磷酸化。ERK 參與許多底物磷酸化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、分化和細(xì)胞凋亡等一系列生理活動(dòng)。

表1 各組腓腸肌IGF-1、p-MAPK、p-MEK和p-ERK1/2表達(dá)(/GAPDH)

表2 各組腓腸肌MyoD1和MyoG mRNA表達(dá)(/β‐actin)

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖和分化主要依靠骨骼肌特異性轉(zhuǎn)錄因子MyoD和MyoG的調(diào)節(jié)[24]。MyoD主要在活化的肌衛(wèi)星細(xì)胞中表達(dá)，是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞活化標(biāo)志[25]；MyoG 則在胚胎期和新生兒期骨骼肌發(fā)育過程中與肌纖維形成有關(guān)，可能與骨骼肌成肌細(xì)胞的分化、融合為肌管的過程有關(guān)，是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的標(biāo)志[26]。MyoD 和MyoG 分別參與骨骼肌成肌前體細(xì)胞的增殖與分化[27]。

本團(tuán)隊(duì)前期從骨骼肌急性損傷后的修復(fù)機(jī)制、前期炎癥、后期修復(fù)等做了大量的前期實(shí)驗(yàn)研究[28]，發(fā)現(xiàn)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能顯著提高骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中多種因子表達(dá)，促進(jìn)大鼠腓腸肌損傷的修復(fù)[29‐31]。本研究顯示，在骨骼肌損傷后24 h 內(nèi)介入干預(yù)，有助于骨骼肌形態(tài)學(xué)恢復(fù)；損傷早期介入跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和按摩均對(duì)骨骼肌損傷后MAPK/MEK 通路有促進(jìn)作用，其中聯(lián)合訓(xùn)練并不優(yōu)于單純干預(yù)，尤以跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果最為顯著；但按摩對(duì)IGF‐1 的表達(dá)效果最佳，而跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)反而降低IGF‐1 的表達(dá)。Kraener[32]研究顯示，急性運(yùn)動(dòng)和慢性運(yùn)動(dòng)后對(duì)IGF‐1 的表達(dá)均無顯著性影響[33]。在骨骼肌受到機(jī)械負(fù)荷刺激后，不同表型IGF‐1 表達(dá)水平有異，其中明顯升高的只是其異構(gòu)體機(jī)械生長(zhǎng)因子(mechano growth factor,MGF)。運(yùn)動(dòng)后，MGF 表達(dá)先于IGF‐1[34]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練應(yīng)以耐力訓(xùn)練為主，可能會(huì)較好刺激IGF‐1 表達(dá)，同時(shí)應(yīng)早期檢測(cè)MGF的表達(dá)水平。

本研究顯示，損傷后24 h內(nèi)干預(yù)，可促進(jìn)MyoD1表達(dá)，尤以按摩效果最為明顯，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)次之。主要可能與IGF‐1的表達(dá)量升高。IGF‐1在介導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化和蛋白質(zhì)合成降解過程中，通過多種信號(hào)通路發(fā)揮作用。既通過MAPK/MEK 信號(hào)途徑誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，也可通過促進(jìn)MyoD 和p21 的表達(dá)，參與誘導(dǎo)成肌細(xì)胞增殖分化[35]。MyoG 的表達(dá)在模型組升高最為明顯，干預(yù)各組均呈降低趨勢(shì)，MyoD1 與MyoG 的表達(dá)具有相對(duì)性，與Muller 等[36]研究結(jié)果一致，也與Sakuma 等[37]關(guān)于快肌和慢肌中MyoD 與MyoG 表達(dá)不一致的研究結(jié)果一致。腓腸肌纖維主要由Ⅱ型肌纖維組成，屬于快肌[38]，MyoD的表達(dá)要高于MyoG。

綜上所述，骨骼肌急性損傷后24 h 內(nèi)介入跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能有效提高肌肉組織中p‐MAPK、p‐MEK、p‐ERK1/2 的表達(dá)，通過激活MAPK/MEK 通路促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化和肌管融合，加快肌肉組織修復(fù)，其效果優(yōu)于按摩；但按摩可能針對(duì)更為廣泛的信號(hào)通路發(fā)揮作用。本團(tuán)隊(duì)以前的研究發(fā)現(xiàn)[29]，骨骼肌損傷24 h 后介入跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和按摩干預(yù)，聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單一干預(yù)。還有待進(jìn)一步研究。

以往治療骨骼肌損傷都是在損傷后24 h 后介入，本研究于骨骼肌損傷后24 h 內(nèi)干預(yù)是一個(gè)全新的嘗試。損傷后早期介入干預(yù)，可促進(jìn)MAPK/MEK 通路的激活，而MAPK/MEK 通路是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的重要影響因素，并對(duì)抑制骨骼肌纖維化有積極作用[8]。早期介入有可能避免運(yùn)動(dòng)員損傷后的瘢痕修復(fù)及其帶來的運(yùn)動(dòng)能力下降，值得進(jìn)一步研究。