趙秋龍，卞曉坤，錢大瑋*，張麗，陳菲菲 ，郭盛，嚴輝，王團結，趙建軍，段金廒

1.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；3.寧夏醫(yī)科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004

牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，性苦、辛，微寒，有清熱涼血、活血化瘀之效[1]?，F(xiàn)代研究表明，牡丹皮中主要含有酚及酚苷類、單萜苷類、有機酸類、黃酮類、苯丙素類及鞣質類等化學成分[2-3]，這些成分多具有顯著的生物活性，為牡丹皮發(fā)揮傳統(tǒng)功效提供物質基礎。牡丹皮產地傳統(tǒng)加工方法為夏、秋二季，選晴天，分次采割后曬干。傳統(tǒng)干燥方法存在干燥周期長、易受天氣條件影響、干燥后藥材質量不均一等弊端[4]。近年來，基于現(xiàn)代干燥原理與技術的干燥方法逐漸應用于中藥材產地加工過程中，并表現(xiàn)為效率高、條件可控、產品質量穩(wěn)定等優(yōu)點[5]。

本研究擬通過分析不同干燥條件處理后牡丹皮中各類成分的含量變化規(guī)律，優(yōu)化和建立牡丹皮藥材適宜的干燥方法及條件，為牡丹皮藥材的產地干燥提供依據(jù)。

1 材料

電熱鼓風干燥機(上海一恒科學儀器有限公司)；隧道式中短波紅外干燥機(江蘇泰州圣泰科紅外科技有限公司)；隧道式微波干燥機(南京研正微波設備廠)；ACQUITY UPLC系統(tǒng)(四元泵溶劑系統(tǒng)，在線脫氣機，自動進樣器，二極管陣列檢測器；Waters公司)；Xevo TQ檢測器(Waters公司)；MassLynx4.1質譜工作站(Waters公司)；ML204電子分析天平、MS105電子分析天平(萬分之一，梅特勒-托尼多儀器有限公司)；水分測定儀(德國Adam公司)；KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)儀器有限公司)；D2012高速臺式離心機(大龍興創(chuàng)實驗儀器北京有限公司)。

牡丹皮新鮮藥材采挖于安徽亳州譙城區(qū)譙東鎮(zhèn)牡丹皮種植基地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學嚴輝副教授鑒定為毛茛科植物牡丹的新鮮根皮，憑證標本存放于江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心。對照品：丹皮酚原苷(批號：DPYG20161220)、牡丹皮苷C(批號：MDGC20151211)、丹皮酚(批號：DPF20160828)、氧化芍藥苷(批號：YHYG20151121)、芍藥苷(批號：SYG20160108)、沒食子酰芍藥苷(批號：MSYG20160601)、苯甲酰芍藥苷(批號：BJYG20161011)、沒食子酸(批號：MSZS20140901)、對羥基苯甲酸(批號：DQJS20141212)、沒食子酸甲酯(批號：MSJZ20161013)、苯甲酸(批號：BJS20161109)、兒茶素(批號：ECS20160315)、槲皮素(批號：HPS20160618)、6-羥基香豆素(批號：QJDS20160921)、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖(批號：QMTT20160811)、香草乙酮(批號：XCYT20161102)均購自南京春秋生物工程有限公司，純度≥98%；甲醇(南京化學試劑有限公司)為分析純，乙腈(Merck)及甲酸(美國ACS公司)均為色譜純，超純水由Milli-Q純水機制備。

2 方法

2.1 干燥加工方法

取牡丹皮新鮮藥材，清洗攤曬，待表面水分揮干，混合均勻，隨機分成14份，每份約1 kg，按表1所示加工方法進行干燥。干燥前取適量新鮮藥材，測定其初始含水率，干燥過程觀察、稱質量并計算實時含水率，當含水率達到13.0%時，停止干燥并留樣。

表1 牡丹皮藥材不同干燥方法樣品信息

2.2 色譜及質譜條件

色譜分析條件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(0～5 min，95%～90%A；5～7 min，90%～75%A；7～10 min，75%～50%A；10～15 min，50%～5%A)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：3 μL。進樣前以流動相初始條件平衡5 min。

質譜檢測條件：ESI源；掃描方式ESI+、ESI-模式；多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓：3 kV，錐孔電壓：20 V，萃取電壓：3 V，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：400 ℃；錐孔氣流量：50 L·h-1；輔助氣流：0.15 mL·min-1；各種成分的質譜參數(shù)見表2。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取丹皮酚原苷、牡丹皮苷C、丹皮酚、氧化芍藥苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、沒食子酸、對羥基苯甲酸、沒食子酸甲酯、苯甲酸、兒茶素、槲皮素、6-羥基香豆素、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖、香草乙酮對照品適量，以甲醇溶解并定容制成各對照品儲備液。精密量取各對照品儲備液適量，置于同一量瓶中，制成混合對照品溶液，其中各成分的質量濃度分別為72.4、63.6、129.4、95.6、121.4、100.7、110.6、122.2、125.7、179.4、121.5、109.1、91.6、120.3、99.40、100.0 μg·mL-1。并將上述混合對照品溶液用甲醇稀釋成不同濃度的混合工作液。

2.4 供試品溶液的制備

取牡丹皮藥材粉末(過4號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)45 min，放至室溫，稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，13 000 r·min-1(離心半徑4.6 cm)離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1線性關系考察與檢測下限、定量下限測定 精密量取2.3項下混合對照品工作液3 μL，按2.2項下的分析條件進行測定。以被測化合物質量濃度X為橫坐標，相應峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，并按信噪比(S/N)為10和3分別計算被測成分的定量下限(LOQ)和檢測下限(LOD)。結果見表3，各成分線性良好，r均在0.990 0以上。

2.5.2精密度試驗 取中濃度混合對照品工作液，按2.2項下色譜條件下連續(xù)進樣6次以測定待測成分的峰面積，各指標成分峰面積的RSD值評價儀器精密度，結果見表4。

2.5.3重復性試驗 取1號樣品6份，按2.4項下方法制備供試品溶液，分別進樣分析，以各指標峰面積的RSD值評價重復性，結果見表4。

2.5.4穩(wěn)定性試驗 取1號樣品，按2.4項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣測定，以樣品中各指標成分峰面積計算RSD，結果見表4。

2.5.5加樣回收率試驗 取0.5 g已知含量的1號樣品6份，每份精密稱定，加入與樣品中各成分含量相近的各對照品，按2.4項下方法制備供試品溶液并按上述條件測定，計算平均回收率和RSD值。結果見表4。

表2 牡丹皮中各成分MRM參數(shù)

表3 各成分回歸方程、線性范圍、檢測下限與定量下限

表4 各成分方法學考察

2.6 樣品測定

取不同干燥方法處理的樣品及一份鮮品適量，制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣測定。每個樣品平行3次，以均值作為測定結果，見表5。

3 結果與分析

3.1 主成分分析(PCA)

為綜合評價不同干燥方法對牡丹皮化學成分的影響，以1～14號干燥品各類成分含量組成14×16矩陣，采用SPSS 22.0對矩陣進行主成分分析(PCA)。

前4個主成分的特征值均大于或接近1，見表6，說明前4個因子在反映牡丹皮不同干燥品的內在質量起著主導作用，4個主成分的累計貢獻率達82.844%，能夠較客觀地反映牡丹皮不同干燥品的內在質量，故選取4個主成分進行分析。

牡丹皮苷C、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、兒茶素、6-羥基香豆素、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖在PC1上有較高載荷，見表7，說明PC1主要反映了這些物質的信息；同理，PC2主要反應了丹皮酚、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、苯甲酸、香草乙酮等成分的信息；PC3主要反應了對羥基苯甲酸、槲皮素的信息；PC4主要反應了丹皮酚原苷、沒食子酸的信息。即前4個主成分基本包含了所測牡丹皮16個成分的信息。

采用4個主成分對牡丹皮不同干燥方法進行評價。以各主成分因子得分與方差貢獻率乘積之和相加，得出各牡丹皮干燥品各類成分總因子得分值F，其綜合評價函數(shù)為：F=0.342 61F1+0.234 77F2+0.143 22F3+0.107 84F4。

按綜合評價函數(shù)計算出不同干燥品的綜合得分(F)，見表8。由綜合得分可知，紅外40 ℃干燥得分最高，紅外50 ℃次之。

表5 不同干燥方法牡丹皮樣品中各成分的質量分數(shù)(n=3) mg·g-1

樣品編號對羥基苯甲酸沒食子酸甲酯苯甲酸兒茶素槲皮素6-羥基香豆素1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖香草乙酮10.1730.0130.0391.7060.0461.5785.7330.30920.1720.0150.0431.7110.0451.5775.7340.32930.2310.0130.0411.7190.0421.5856.1430.44340.2180.0160.0391.7190.0431.5856.4350.34650.1910.0180.0451.8210.0461.6768.1060.51760.2140.0220.0431.7360.0441.5917.1020.54270.2550.0170.0461.7240.0451.5935.9740.49680.2400.0130.0421.7230.0431.5906.7950.30890.1750.0160.0451.7180.0461.5915.8270.374100.2370.0200.0401.7210.0431.5916.5920.401110.1820.0210.0461.7300.0431.5776.6450.579120.1760.0150.0411.6980.0471.5645.4820.553130.2260.0010.0411.7210.0431.5885.8820.293140.2430.0020.0321.7230.0431.5946.7470.272150.2920.0170.0522.7410.0682.79410.0800.548

表6 主成分的特征值及貢獻率

4 討論

通過分析不同干燥方法對牡丹皮中各類成分的影響發(fā)現(xiàn)，干燥后干燥品中酚及酚苷類成分(丹皮酚原苷、牡丹皮苷C、丹皮酚)含量變化最大、變化范圍寬。研究表明，酚類物質在植物體內的生物合成及代謝易受多酚氧化酶(PPO酶)的影響而氧化成醌類成分[6-7]。上述酚類成分的變化可能由不同干燥條件下PPO酶活性的不同引起的。此外，丹皮酚為牡丹皮藥材中最主要的成分，除微波干燥外，在其他兩種現(xiàn)代干燥方式下，隨著干燥溫度升高，丹皮酚含量先升高后降低，60 ℃時達到最大，這可能由于：60 ℃以下，隨著溫度升高，丹皮酚含量損失時間變短，此階段干燥時間是主要因素；60 ℃以后，隨著溫度升高，丹皮酚受熱揮發(fā)含量降低，此階段溫度是主要因素[8]。

表7 旋轉變換后的因子載荷矩陣

表8 不同干燥加工方法處理的牡丹皮成分含量綜合評分

單萜苷類成分(氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、沒食子酰芍藥苷及芍藥苷)含量變化趨勢相似，紅外>微波>熱風，這可能由于熱風干燥速率慢，物料內部不能迅速脫水，干燥時間較長使得單萜苷類水解損失較多[9]。微波雖然干燥速率較快，但在干燥初期有一個瞬間升溫的過程，此過程可能對牡丹皮中單萜苷類成分造成破壞損失。

有機酸類成分(沒食子酸甲酯、苯甲酸、對羥基苯甲酸、沒食子酸)中沒食子酸是主要成分，含量較高，干燥溫度對沒食子酸含量影響較大，快速低溫干燥提高了沒食子酸的穩(wěn)定性[10]，且40～60 ℃沒食子酸含量較高。

黃酮類成分槲皮素、兒茶素兩者在曬干后含量下降最多，有研究表明光照促進了槲皮素、兒茶素這兩個成分分解。1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖為鞣質類成分，其在干燥后含量較鮮品均降低，這可能由于鞣質類成分對濕熱較敏感，采用一般的干燥方法不能保存其主要成分，其在濕熱條件下可能會降解[11]。而6-羥基香豆素為苯丙素類，其在3種現(xiàn)代干燥方式下變化趨勢相似，均隨溫度升高，含量先升高后降低，在溫度為50～60 ℃時含量較高，且干燥后含量均低于鮮品，曬干樣品中的6-羥基香豆素含量最高[12]。這可能由于6-羥基香豆素為苯丙素類，具有鄰羥基桂皮酸內酯結構，具有熱不穩(wěn)定性，干燥溫度低有利于有效物質的保留[13]。

本研究分析了不同條件干燥后各樣品成分含量，發(fā)現(xiàn)紅外40 ℃干燥綜合得分最高，說明藥材的綜合品質最好，并且分析了不同干燥方式下牡丹皮藥材中各類成分含量的變化，為后續(xù)牡丹皮藥材產地干燥過程中穩(wěn)定藥材品質提供了支撐，也為根類藥材產地加工共性技術的形成提供了有益的探索和實踐。