江虹，劉艷，李俠

(長江師范學院 化學化工學院，重慶 408100)

食品添加劑分為化學合成物質(zhì)和天然物質(zhì)兩大類，合成添加劑的毒性大于天然添加劑，尤其在添加劑本身質(zhì)量不純，混有有害物質(zhì)或超量使用時很容易對人體造成危害，而食品業(yè)使用的絕大多數(shù)添加劑是化學合成物質(zhì)，甜蜜素就是人工合成的一種甜味添加劑，它的甜度為蔗糖的30～50 倍，現(xiàn)被廣泛用于糕點、飲料及其他食品中。由于過度使用甜蜜素，會對人體造成一定危害，如引起人體病變，出現(xiàn)畸形、癌癥、損壞腎功能等，因此，我國食品安全標準GB 2760 中對甜蜜素在食品中的使用范圍和使用限量作了明確規(guī)定，如面包和糕點中甜蜜素不得大于1.6 g/kg，餅干和飲料中甜蜜素不得大于0.65 g/kg，盡管如此，食品業(yè)的超限量、超范圍違規(guī)使用仍時有發(fā)生。目前，國內(nèi)外對食品中甜蜜素的研究方法主要有：高效液相色譜法[1-4]、氣相色譜法[5-7]、分光光度法[8-9]、電化學法[10-13]、液-質(zhì)聯(lián)用法[14-19]及氣-質(zhì)聯(lián)用[20]等。我國食品安全國家標準GB 1886.37—2015對甜蜜素的檢測方法為高氯酸滴定法，此法所用的部分試劑具有毒性或腐蝕性，所用的溶劑冰乙酸就是一種酸性腐蝕性物質(zhì)，有強烈的刺激性，對人體健康有一定危害；而滴定劑高氯酸不僅具有毒性、強的腐蝕性，還具有燃燒爆炸的危險性。而現(xiàn)在研究較多的高效液相色譜法、氣相色譜法及液-質(zhì)、氣質(zhì)聯(lián)用等對樣品的前處理工作較為繁瑣、尤其是凈化處理耗時較多。分光光度法雖操作簡便，有較高的準確度和精密度，但靈敏度和選擇性欠佳。電化學法的條件要求較為苛刻?；诖?，研究簡便、快速、靈敏的甜蜜素檢測方法很有必要。本實驗采用高靈敏共振光散射技術(shù)，借維多利亞藍B 與甜蜜素反應生成離子締合物，使顯著增強的共振光散射信號與甜蜜素的質(zhì)量濃度呈線性關系，建立了測定低脂、低蛋白類焙烤食品及飲料中甜味添加劑——甜蜜素的檢測方法，該方法目前尚未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜蜜素(cyclamate)標準物質(zhì)：GBW(E)100066，99.3%，中國食品藥品檢定研究院；維多利亞藍B(victoria blue B)：99%，武漢易泰科技有限公司上海分公司；三羥甲基氨基甲烷(tris)：99.9%，上海吉至生化科技有限公司；鹽酸：AR級，重慶川東(化工)集團有限公司；樣品：面包(1#)、餅干(2#)、果味飲料(3#)、可樂型碳酸飲料(4#)，市售。

甜蜜素標準溶液：貯備液為1.00×10-3mol/L水溶液，操作液由貯備液稀釋配制成1.00×10-5mol/L水溶液，冰箱4 ℃保存。維多利亞藍B溶液：貯備液為1.00×10-3mol/L水溶液，操作液由貯備液稀釋配制成1.00×10-4mol/L水溶液；Tris-HCl 溶液：由Tris 溶液和HCl 溶液混合，用pH 計測定，配成pH 3.0～9.8的系列溶液。

1.2 儀器與設備

F-2500型熒光分光光度計,日本日立公司；EL104型電子天平,上海精密儀器儀表有限公司；TD5A-WS 型離心機,湖南湘儀離心機儀器有限公司；KQ-200VDE 超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司；pHS-3C 型精密酸度計,上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 樣品處理

準確稱取已粉碎、混勻的低脂、低蛋白面包及餅干樣品各2～3 g(精確至±0.000 1 g)，加適量水，攪拌、浸提10 min，再超聲20 min、離心(4 500 r/min)5～10 min，上清液用水定容至100 mL，得到待測液1# 和2#。

準確移取3#和4#飲料各10.00 mL，在溫熱水浴中超聲20 min，用水定容至500 mL，得到待測液3#和4#。

1.4 實驗方法

于10 mL 具塞比色管中，準確加入2.50 mL 維多利亞藍B 操作液、1.50 mL pH 9.27 Tris-HCl 溶液及0.00～2.00 mL 甜蜜素標準操作液，用水稀釋至刻度，搖勻。靜置20 min 后，在熒光分光光度計上設λex=λem=220 nm，狹縫5 nm，掃描共振光散射光譜，在光譜曲線的特征峰369 nm 處測定體系溶液的共振光散射強度IRLS及試劑空白的共振光散射強度I0，再由IRLS-I0求得體系溶液的共振光散射增強強度ΔIRLS。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜蜜素與維多利亞藍B 的RLS 光譜特征

從圖1可知，單獨的甜蜜素標準操作液的RLS 信號非常微弱，如曲線1所示。

1-1.00×10-6 mol/L 甜蜜素; 2-2.50×10-5 mol/L 維多利亞藍B; 3～7-0.00、0.50×10-6、1.00×10-6、1.50×10-6、2.00×10-6 mol/L 甜蜜素,2.50×10-5 mol/L 維多利亞藍B,pH 9.27混合液

單獨的維多利亞藍B 操作液的RLS 信號較弱，在400 nm 處有一最大散射峰，如曲線2所示。當在維多利亞藍B 操作液中加入Tris-HCl(pH 9.27)溶液后，RLS 信號顯著增強，如曲線3所示。在曲線3 溶液的基礎上加入0.00～2.00 mL 的甜蜜素標準操作液，從曲線3～7可知，光譜曲線在369 nm 處有一最大特征散射峰，此峰與單獨的維多利亞藍B 相比較，紅移31 nm。在體系溶液的特征峰處，一定濃度范圍的甜蜜素的質(zhì)量濃度(或物質(zhì)的量濃度)與體系溶液的共振光散射增強強度ΔIRLS呈線性關系。故選擇369 nm 作為測定波長，用于甜蜜素的定量分析。

2.2 適宜條件的選擇

2.2.1 反應酸度

取甜蜜素標準操作液1.00 mL、維多利亞藍B操作液2.00 mL時，按1.4 節(jié)方法考察1.00 mL pH 3.0～9.8 范圍的Tris-HCl 溶液對甜蜜素-維多利亞藍B 體系ΔIRLS的影響，結(jié)果見圖2。從ΔIRLS-pH 曲線可知，甜蜜素與維多利亞藍B 反應所需加入的Tris-HCl溶液的pH為9.27，當加入的溶液的pH>9.27或<9.27時，體系的ΔIRLS均有不同程度降低，pH 9.27 時，體系的ΔIRLS較大，靈敏度較高。故實驗選用pH 9.27 Tris-HCl 溶液來控制該反應的酸度。

圖2 Tris-HCl 溶液酸度對ΔIRLS的影響

2.2.2 Tris-HCl 溶液(pH 9.27)的用量

取甜蜜素標準操作液1.00 mL、維多利亞藍B操作液2.00 mL，按1.4 節(jié)方法考察0.50～3.00 mL 范圍的pH 9.27 Tris-HCl 溶液對甜蜜素-維多利亞藍B 體系ΔIRLS的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 Tris-HCl(pH 9.27)用量對ΔIRLS的影響

從ΔIRLS-VpH 9.27曲線可知，甜蜜素與維多利亞藍B 反應所需加入Tris-HCl溶液(pH 9.27)的最適用量為1.50 mL，溶液用量大于或小于1.50 mL，體系的ΔIRLS均有不同程度下降。故實驗選擇體系靈敏度最大時的Tris-HCl(pH 9.27)溶液用量為1.50 mL。

2.2.3 維多利亞藍B 濃度

取甜蜜素標準操作液1.00 mL、pH 9.27 Tris-HCl 溶液1.50 mL，按1.4 節(jié)方法考察0.50～3.00 mL 范圍的維多利亞藍B 操作液對甜蜜素-維多利亞藍B 體系ΔIRLS的影響，結(jié)果見圖4。從ΔIRLS-c維多利亞藍B曲線可知，維多利亞藍B 的最適濃度為2.50×10-5mol/L(即維多利亞藍B 操作液的最適用量為2.50 mL)，當維多利亞藍B 濃度大于或小于該值時，體系ΔIRLS均有不同程度下降，當<2.50×10-5mol/L 時，維多利亞藍B 用量不夠，與甜蜜素反應不完全；當>2.50×10-5mol/L 時，又因維多利亞藍B 過量使自身聚集作用增強從而影響與甜蜜素間的反應，靈敏度隨之下降。故實驗選擇體系靈敏度最大時的維多利亞藍B 溶液的濃度即2.50×10-5mol/L。

圖4 維多利亞藍B 濃度對ΔIRLS 的影響

2.2.4 試劑加入順序

取甜蜜素標準操作液1.00 mL、pH 9.27 Tris-HCl 溶液1.50 mL、維多利亞藍B 操作液2.50 mL，按1.4 節(jié)方法考察這幾種物質(zhì)在加入順序不同時對體系ΔIRLS的影響。結(jié)果顯示，這幾種物質(zhì)加入的先后順序?qū)μ鹈鬯嘏c維多利亞藍B 反應的ΔIRLS有一定影響。當加入順序為維多利亞藍B 溶液、Tris-HCl 溶液、甜蜜素溶液時，體系的ΔIRLS=1315(相對于其他加入順序，該順序的ΔIRLS最大)，靈敏度相對其他順序最高。故實驗選擇此最佳順序加入各物質(zhì)。

2.2.5 反應時間及穩(wěn)定性

按上述選定的最佳條件，考察甜蜜素與維多利亞藍B 的反應在5～100 min 范圍內(nèi)對體系ΔIRLS的影響。結(jié)果顯示，反應從開始至20 min 時，隨著反應時間的增加，體系ΔIRLS逐漸增大，表明此時間段的反應并未完全；當反應至20～70 min 范圍，隨著反應時間的增加，體系的ΔIRLS不再增大，基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，表明此時間段內(nèi)反應已完全，并可穩(wěn)定50 min；當反應至70 min 后，體系的ΔIRLS隨時間的增加而逐漸下降，表明生成的新物質(zhì)在此段時間已不再穩(wěn)定。故測定時間選在新物質(zhì)穩(wěn)定時間段內(nèi)進行。

2.3 工作曲線及相關參數(shù)

按1.4 節(jié)的實驗方法，配制0.00、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 甜蜜素標準操作液的標準系列溶液，掃描RLS 光譜，作甜蜜素的標準曲線，見圖5。該方法的一元線性回歸方程為ΔIRLS=14.20+7 038ρ，相關系數(shù)r=0.999 7，線性范圍為0.004～0.4 mg/L，檢出限為0.003 5 mg/L，面包和餅干的定量限為2.69 mg/100 g，飲料的定量限為29.2 mg/L。

圖5 甜蜜素的標準曲線

2.4 離子強度的影響

室溫下，考察了不同質(zhì)量濃度的NaCl 溶液對體系ΔIRLS的影響。結(jié)果顯示，7 400 倍的NaCl 溶液對甜蜜素的測定無影響。故離子強度不影響甜蜜素的測定。

2.5 共存物質(zhì)的影響

2.6 樣品分析

準確移取各待測液0.20 mL 代替1.4節(jié)實驗方法中的甜蜜素標準操作液，加入最佳條件下的維多利亞藍B 和Tris-HCl 溶液，用水定容至10 mL。按實驗方法測定面包、餅干及飲料中的甜蜜素含量，并與GB 1886.37—2015比較。從表1數(shù)據(jù)可知，測定結(jié)果與GB法基本一致，統(tǒng)計學檢驗結(jié)果表明新方法具有可靠性。

表1 面包、餅干及飲料的分析結(jié)果

加標回收試驗：準確稱取1#和2#已粉碎、混勻的面包、餅干樣品各3份，每份2～3 g(精確至±0.000 1 g)，分別置于小燒杯中；準確移取3#和4#飲料各3份，每份10.00 mL，分別置于小燒杯中。在1#～4#的小燒杯樣液中，分別往同一樣液的3份燒杯中加入0.50、1.50和3.00 mL甜蜜素貯備液，后續(xù)操作按1.3節(jié)樣品處理方法進行，制得各待測液。取各待測液0.20 mL，按實驗方法測定各待測液中甜蜜素的含量(n=5)，求回收率，以判斷方法的準確度。結(jié)果見表2。表2中加標回收率和相對標準偏差表明新方法有較高的準確度和精密度。

表2 面包、餅干及飲料的回收試驗(n=5)

3 結(jié)論

維多利亞藍B-甜蜜素體系用于食品中甜蜜素的測定，該方法具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，準確度和精密度滿足定量分析要求，并有較寬的線性范圍。測定結(jié)果的準確度與國標法相比無顯著性差異。本方法適用于焙烤食品中低脂低蛋白的面包、餅干及飲料中甜蜜素的快速測定。