王曉燕，王蓉福，張昊宇，院珍珍,,3，曹效海,3，王樹林,,3*，杜艷

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016) 2(青海省青稞資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，青海 西寧，810016) 3(青海-甘肅食品研發(fā)與檢測(cè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧，810016)

青稞(HordeumvulgareL. var. nudum Hook. f)是禾本科大麥屬作物，主要分布在我國(guó)青藏高原地區(qū)[1]。作為一種重要的高原谷類作物，青稞中含有豐富的礦物質(zhì)、氨基酸和維生素[2-3]，此外，青稞中還含有5.25%左右的β-葡聚糖[2]。與其他谷物類作物相比較，青稞具有“三高兩低”(高蛋白、高纖維、高維生素和低脂肪、低糖)的特點(diǎn)[3]，具有降血脂及降血糖等功效[4]，這些決定了青稞制品是糖尿病患者優(yōu)選的優(yōu)質(zhì)谷物類食物。

盡管青稞作為糖尿病患者食品具有一定優(yōu)勢(shì)，但青稞中淀粉含量與一般谷物相近[5]，具有高消化率，進(jìn)入人體會(huì)導(dǎo)致血糖迅速升高[6]，此特性限制了青稞在糖尿病專用食品開發(fā)方面的應(yīng)用。通過縮短支鏈淀粉的支鏈長(zhǎng)度，增加其支鏈密度，可有效增加淀粉的抗消化性[7]。目前降解淀粉的方法主要有3種：化學(xué)法、生物法、生物化學(xué)法，并以生物法中的酶法為主流方法[8-10]。而關(guān)于利用糖化菌的微生物降解法多運(yùn)用于谷物類食品深加工及降解甘蔗渣等廢料過程中[11-13]。

微生物法降解淀粉雖具有一定的優(yōu)勢(shì)，但必須具備優(yōu)質(zhì)的菌種才可保證其效率[14]。大曲作為釀造青稞酒的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑在釀造過程中起著至關(guān)重要的作用，其中霉菌是大曲在發(fā)酵過程中的糖化菌[15-16]。本試驗(yàn)以大曲為原料，從大曲中篩選出優(yōu)勢(shì)糖化菌，優(yōu)化糖化菌降解青稞中淀粉的發(fā)酵條件，為采用生物法降解青稞淀粉提供理論依據(jù)，從而拓展青稞在糖尿病患者專用食品開發(fā)中的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及試劑

青稞酒大曲：青海青稞酒股份有限公司。

MgSO4，K2HPO4，NaOH，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；察式瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；3,5-二硝基水楊酸，上海中秦化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

尼康E100型生物顯微鏡，北京佳緣興業(yè)科技有限公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理有限公司；WDP-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糖化菌的篩選及鑒定

菌株分離：取青稞酒大曲，參考文獻(xiàn)[17]平板劃線分離直至獲得具有典型形態(tài)的霉菌。

霉菌的形態(tài)鑒定：根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]對(duì)霉菌進(jìn)行制片，在顯微鏡下觀察其形態(tài)，對(duì)霉菌進(jìn)行鑒定[19]。

糖化菌種的篩選：根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]，以糖化力為指標(biāo)，從典型霉菌中篩選最佳糖化菌。在以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中加入菌體，28 ℃條件下培養(yǎng)12 h后，測(cè)定還原糖質(zhì)量。霉菌糖化力單位定義為：1 g菌體每小時(shí)降解淀粉生成還原糖的質(zhì)量。

優(yōu)勢(shì)糖化菌的分子生物學(xué)鑒定：取斜面菌種送樣。DNA提取、ITS鑒定均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.2 優(yōu)勢(shì)糖化菌生長(zhǎng)性能的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[21]的方法將糖化菌分別接種在霉菌液體培養(yǎng)基中，分別考察溫度(31、34、37、40、43、46 ℃)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、NaCl質(zhì)量濃度(20、35、50、65、80 g/L)、發(fā)酵時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7 d)對(duì)米曲霉生長(zhǎng)性能的影響，發(fā)酵培養(yǎng)后，計(jì)算菌體干重[22]，分析米曲霉的生長(zhǎng)性能。

1.2.3 還原糖含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23]采用DNS法測(cè)定青稞發(fā)酵液中還原糖的質(zhì)量，計(jì)算單位質(zhì)量青稞發(fā)酵降解成還原糖的質(zhì)量。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：y=1.078x+0.016 3，R2=0.999 2。

1.2.4 多糖含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[24]，采用苯酚-硫酸法測(cè)定發(fā)酵液中可溶性總糖的質(zhì)量，計(jì)算單位質(zhì)量青稞發(fā)酵降解成可溶性糖的質(zhì)量。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：y=7.489 6x-0.028 3，R2=0.998 7。

1.2.5 降低青稞淀粉工藝及操作要點(diǎn)

工藝流程：菌種活化→種子液制備→發(fā)酵培養(yǎng)→水洗離心→收集固體→烘干→低糖青稞粉

菌種活化：將保存在-80 ℃的優(yōu)勢(shì)糖化菌菌株在察氏瓊脂培養(yǎng)基上斜面接種，在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，重復(fù)2～3次，活化后的菌種保存至4 ℃冰箱待用。

種子液制備：在霉菌液體培養(yǎng)基中接入幾株糖化菌，在28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)：將80目以上的青稞粉與發(fā)酵液以料液畢1∶10(g∶mL)的比例在一定條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

水洗離心：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液去除，離心得到的固體用蒸餾水洗滌并再次離心，重復(fù)2～3次。

烘干：將收集得到的固體放于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干。

1.2.6 利用糖化菌降解青稞淀粉工藝的單因素試驗(yàn)

取1 g青稞粉，加入10 mL發(fā)酵液，分別考察發(fā)酵時(shí)間(1、2、3、4、5 d)、發(fā)酵初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、發(fā)酵溫度(28、31、34、37、40 ℃)和菌種接種量(3%、6%、9%、12%、15%)對(duì)發(fā)酵過程的影響，測(cè)定發(fā)酵液中還原糖及總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以確定各單因素適宜的條件。

1.2.7 微生物降解青稞淀粉的響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)降解青稞淀粉影響較顯著的3個(gè)因素，以發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，采用3因素3水平中心組合設(shè)計(jì)(Box-behnken)[25-26]，對(duì)霉菌降解青稞中糖類化合物的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝條件。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件、Spss 20.0軟件和Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離微生物的菌落形態(tài)特征

分離菌株MJ1、MJ2、MJ3經(jīng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后菌落形態(tài)及特征如表2所示。

表2 不同霉菌菌株的菌落形態(tài)及特征

MJ1、MJ2、MJ3經(jīng)10×光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄的顯微形態(tài)分別如圖1所示。

a-MJ1顯微圖;b- MJ2顯微圖;c- MJ3顯微圖

用光學(xué)顯微鏡觀察，3株霉菌形態(tài)學(xué)特征如表3所示。

表3 不同霉菌菌株的形態(tài)學(xué)特征

2.2 優(yōu)勢(shì)糖化菌的篩選結(jié)果

MJ1、MJ2、MJ3菌株糖化力分別為(58.59±3.98)、(359.62±9.71)、(148.83±3.60)μg/(g·h)，即菌株MJ2糖化力最高且明顯高于MJ1和MJ3，具有明顯降糖優(yōu)勢(shì)。

2.3 優(yōu)勢(shì)糖化菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將獲得的優(yōu)勢(shì)糖化菌ITS基因序列在NCBI上進(jìn)行blast比對(duì)，長(zhǎng)度為529 bp。序列比對(duì)在99%以上的霉菌為絲衣霉屬(Byssochlamys)，踝節(jié)菌屬(Talaromyces)，擬青霉屬(Paecilomyces)，淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)，曲霉屬(Aspergillus)。

結(jié)合表2及表3的鑒定結(jié)果，并依據(jù)其他參考文獻(xiàn)[27]對(duì)優(yōu)勢(shì)糖化菌屬種鑒定為：曲霉屬，米曲霉。

2.4 優(yōu)勢(shì)糖化菌生長(zhǎng)性能測(cè)定

由圖2可知，糖化菌的最適生長(zhǎng)溫度在40 ℃左右，此時(shí)培養(yǎng)基中出現(xiàn)圓潤(rùn)的菌絲小球，在40 ℃附近，更適宜米曲霉菌絲體的形成；隨著pH的降低，米曲霉的生長(zhǎng)逐漸旺盛，pH為4時(shí)，具有最好的生長(zhǎng)性能；pH為3時(shí)，生長(zhǎng)速度稍有下降，表明米曲霉更適宜在酸性條件下生長(zhǎng)，米曲霉在過低和過高濃度鈉鹽環(huán)境下，生長(zhǎng)緩慢，而在3.5%～6.5%條件下，生長(zhǎng)良好，一定濃度的鈉離子可以輔助米曲霉的生長(zhǎng)，鈉離子濃度過大，不利于霉菌的生長(zhǎng)，此結(jié)果表明篩選的糖化菌株具有一定的耐鹽性；米曲霉生長(zhǎng)曲線如圖2-d所示，可初步判斷0～3 d為米曲霉的生長(zhǎng)遲滯期，3～5 d為對(duì)數(shù)期，6～7 d為穩(wěn)定期。

圖2 優(yōu)勢(shì)糖化菌生長(zhǎng)性能測(cè)定

2.5 微生物降解青稞淀粉工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液中糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是衡量降解青稞淀粉效果的重要指標(biāo)。由圖3可知，發(fā)酵3 d時(shí)，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，發(fā)酵過程中糖化作用致使糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，但積累至一定濃度會(huì)抑制降解過程，故隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，故選取適宜的發(fā)酵時(shí)間為3 d；發(fā)酵液中糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著起始pH的變化沒有明顯的規(guī)律性變化，發(fā)酵后發(fā)酵液的pH都呈酸性，起始pH為7的條件容易控制，故確定適宜的起始pH為7；溫度為37 ℃時(shí)，糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，溫度過低抑制微生物的生長(zhǎng)，過高的溫度則使得微生物生長(zhǎng)代謝受阻[26]，從而降解淀粉能力減弱，故選取37 ℃為適宜的發(fā)酵溫度；接種量為6%時(shí)，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，接種量過小需要延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，接種量過大時(shí)，菌體繁殖速度過快，糖化菌生長(zhǎng)活力下降，故選取適宜接種量為6%。

圖3 各因素對(duì)糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4；回歸模型的方差分析見表5。

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

用Design-Expert 8.0.6.1 對(duì)表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到試驗(yàn)因素對(duì)還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多元回歸方程：

表5 二次回歸模型方差分析結(jié)果

注：“**”表示差異極顯著(P<0.01),“*”表示差異顯著(P<0.05)

2.6.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

由圖4可知，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高時(shí)發(fā)酵時(shí)間應(yīng)該在2.50～3.50 d之間，發(fā)酵溫度應(yīng)該在36～38 ℃之間，最佳接種量在6%～7%之間。

圖4 因素交互作用對(duì)還原糖含量影響的響應(yīng)面圖

由圖4可以看出，發(fā)酵時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響大于發(fā)酵溫度和接種量的影響，接種量對(duì)還原糖含量的影響大于發(fā)酵溫度的影響，即各因素對(duì)還原糖含量的影響作用大小為：發(fā)酵時(shí)間>接種量>發(fā)酵溫度，各因素兩者的交互作用對(duì)青稞發(fā)酵液中還原糖含量的影響都較小。

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)分析所得的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到青稞發(fā)酵液中還原糖含量為(77.4±4.54)mg/g，分析所得的理論預(yù)測(cè)值為80.1 mg/g，相對(duì)誤差為3.4%，與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果相符，所以基于響應(yīng)面法所得的糖化菌發(fā)酵參數(shù)可靠，回歸模擬方程預(yù)估發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有可行性。

3 結(jié)論

在青稞糖化菌的篩選試驗(yàn)中，以富含霉菌的大曲為原料，成功篩選出糖化力為(359.62±9.71)μg/(g·h)的優(yōu)勢(shì)糖化菌株，鑒定其為米曲霉。米曲霉的最適生長(zhǎng)溫度為40 ℃，最適生長(zhǎng)pH為4，對(duì)鈉離子具有一定的耐受性，其生長(zhǎng)性能良好，具有較好的適應(yīng)能力。經(jīng)過發(fā)酵降解青稞淀粉工藝優(yōu)化后，微生物降解青稞中糖類化合物的能力有所提高。在此試驗(yàn)中，為微生物法降解青稞淀粉提供了良好的菌種，為微生物法降解青稞淀粉提供了技術(shù)支持和理論依據(jù)。