趙鵬鵬，雷淑珍，徐曉光，王蓉，蔣春美，師俊玲

(西北工業(yè)大學(xué) 生命學(xué)院，陜西 西安，710072)

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是目前成功用于實際生產(chǎn)的生防菌之一，能夠有效防治由鐮刀菌引起的草莓枯萎病、蘭花枯萎病等農(nóng)業(yè)病害，對稻瘟病菌、鏈格孢菌等病菌也有較強的拮抗活性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，該菌能夠產(chǎn)生蛋白、 多肽、小分子量抗生素等多種抑菌物質(zhì)，表現(xiàn)出很好的實際應(yīng)用效果與前景[3]。

根據(jù)已有報道，芽孢桿菌代謝合成抑菌物質(zhì)的種類與產(chǎn)量與培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件緊密有關(guān)，通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成，可以顯著提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性[4-5]。亦有報道指出，優(yōu)化培養(yǎng)基組成能夠促進(jìn)貝萊斯芽孢桿菌的細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成[6-8]，但針對性提高其抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的相關(guān)研究并不多見。

為獲得高抑菌活性，特別是抑真菌活性的貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物，本文較為系統(tǒng)地考察了培養(yǎng)基組成對貝萊斯芽孢桿菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)種類和活性的影響規(guī)律，并優(yōu)化培養(yǎng)條件，以期為生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 微生物

貝萊斯芽孢桿菌由本實驗室從土壤中分離獲得，并經(jīng)分子生物學(xué)分類鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)Landy培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，L-谷氨酸鈉5.0 g，蛋白胨10.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.15 mg，MnSO45.0 mg，CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL，初始pH為7.0。

(2)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)：葡萄糖20.0 g，牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)初始pH為7.0。

(3)營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(NA)：在NB培養(yǎng)基中額外加入20 g/L瓊脂，用于貝萊斯芽孢桿菌的保藏與活化。

(4)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，用于炭黑曲霉的培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基種類對貝萊斯芽孢桿菌細(xì)胞生長和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的影響

Landy培養(yǎng)基被廣泛用于培養(yǎng)芽孢桿菌，NB培養(yǎng)基則是用于培養(yǎng)細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)基。分別在這2種培養(yǎng)基(pH 7.0)中接種等量菌種，在32 ℃、160 r/min的條件下培養(yǎng)時間48 h后，離心取菌體，測菌體生物量，以及發(fā)酵液的最終pH值和抑菌活性。

1.2.2 培養(yǎng)基組成對抑菌活性物質(zhì)組成的影響

在Landy培養(yǎng)基中分別加牛肉膏(5 g/L)、NaCl(5 g/L)、蛋白胨(10 g/L)、牛肉膏(5 g/L)+蛋白胨(10 g/L)等NB培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分，并以Landy培養(yǎng)基作為對照，在相同條件下培養(yǎng)48 h后，檢測菌體生物量，發(fā)酵液pH和和抑菌活性。

1.2.3 培養(yǎng)基組成優(yōu)化

以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別改變其中各組分含量，研究NaCl、牛肉膏、蛋白胨、組合氮源、金屬離子和谷氨酸鈉對菌體生長和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的影響。實驗中所用各因素的水平設(shè)置如表1所示。

表1 實驗中所用因素與水平

注： 1份離子溶液中含有KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.15 mg/L，MnSO45.0 mg/L，CuSO40.16 mg/L

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基種類對菌體生長與抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的影響

如圖1所示，相對于NB培養(yǎng)基，貝萊斯芽孢桿菌在Landy培養(yǎng)基中的最終pH值和細(xì)胞生物量較高，但所得發(fā)酵液的抑菌圈直徑卻顯著低于NB培養(yǎng)基。

圖1 培養(yǎng)基種類對發(fā)酵液pH、生物量和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的影響

實驗結(jié)果說明該菌的細(xì)胞生長條件與抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生條件有所不同。相對而言， Landy培養(yǎng)基更有利于貝萊斯芽孢桿菌的菌體生長，而NB培養(yǎng)基則更有利于抑菌活性物質(zhì)的合成。

2.2 培養(yǎng)基組成對抑菌活性物質(zhì)組成的影響

如圖2所示，牛肉膏、蛋白胨和NaCl的添加能夠不同程度地降低發(fā)酵液的最終pH值和菌體生長量，同時發(fā)酵液中殘?zhí)呛枯^高(4.2 g/L)，說明這些物質(zhì)抑制了菌體生長。同時NaCl或牛肉膏的添加能夠提高發(fā)酵液抑菌活性，但添加蛋白胨和同時添加牛肉膏和蛋白胨反而會降低發(fā)酵液抑菌活性。這說明蛋白胨會抑制抑菌物質(zhì)合成。值得一提的是，即使在Landy培養(yǎng)基中添加與NB培養(yǎng)基中相同濃度的各類物質(zhì)，發(fā)酵液的抑菌活性也達(dá)不到NB培養(yǎng)基水平。這說明Landy培養(yǎng)基中一些成分會抑制抑菌物質(zhì)的合成。

a-Landy培養(yǎng)基；b-Landy培養(yǎng)基+10 g/L蛋白胨；c-Landy培養(yǎng)基+10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏；d-Landy培養(yǎng)基+5 g/L牛肉膏；e-Landy培養(yǎng)基+5 g/L NaCl；f-NB培養(yǎng)基

進(jìn)一步改變NB培養(yǎng)基中NaCl(圖3)、牛肉膏(圖4)、蛋白胨(圖5)、組合氮源(圖6)的濃度，以及添加金屬離子(圖7)和谷氨酸鈉(圖8)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了在組合氮源實驗中發(fā)酵液抑菌活性，隨著牛肉膏添加量增大而降低外，在其他實驗中均呈現(xiàn)，隨著添加物濃度增大先上升后下降的趨勢，并且在NaCl 5 g/L、牛肉膏15 g/L、蛋白胨 10 g/L、金屬離子2 份、谷氨酸鈉5 g/L時，達(dá)到最大值。多種氮源組合添加時，以同時添加10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏時所得發(fā)酵液的抑菌活性最大。對比不同條件下所得發(fā)酵液的最大抑菌圈直徑可以發(fā)現(xiàn)：補充谷氨酸鈉和金屬離子能夠大幅度提高發(fā)酵液的抑菌活性，然后依次為牛肉膏單一添加組、NaCl添加組、組合氮源組，而蛋白胨添加組的抑菌活性遠(yuǎn)低于其他組。說明蛋白胨的添加會抑制抑菌物質(zhì)的合成。

圖3 NB培養(yǎng)基中NaCl含量對發(fā)酵液pH、生物量和發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖4 NB培養(yǎng)基中牛肉膏含量對發(fā)酵液pH、生物量和發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖5 NB培養(yǎng)基中蛋白胨含量對發(fā)酵液pH、生物量和發(fā)酵液抑菌活性的影響

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，添加谷氨酸鈉和金屬離子時，對應(yīng)于最大抑菌圈時的菌體生物量和發(fā)酵結(jié)束時的pH值也會較高。從而說明，這些指標(biāo)之間存在一定的相關(guān)性。通過優(yōu)化組合，可得發(fā)酵液抑菌活性最高的培養(yǎng)基組成為：每升培養(yǎng)基中含有葡萄糖20 g，NaCl 5 g，牛肉膏15 g，谷氨酸鈉5 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，KCl 1 g，F(xiàn)eSO40.3 mg，MnSO410 mg，CuSO40.32 mg。使用該培養(yǎng)基可使菌體生物量增加90%，60 μL發(fā)酵液的抑菌圈直徑可達(dá)(23.4±0.47) mm，比抑菌效果較好的NB培養(yǎng)基提高了21.9%。

a-10 g/L蛋白胨和5 g/L牛肉膏；b-10 g/L蛋白胨和10 g/L牛肉膏;c-10 g/L蛋白胨和15 g/L牛肉膏；d-10 g/L蛋白胨和20 g/L牛肉膏；e-10 g/L蛋白胨和25 g/L牛肉膏

圖7 NB培養(yǎng)基中離子溶液份數(shù)對發(fā)酵液pH、生物量和發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖8 NB培養(yǎng)基中谷氨酸鈉含量對發(fā)酵液pH、生物量和發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3 培養(yǎng)基對發(fā)酵液中脂肽類抑菌活性物質(zhì)抗稀釋濃度的影響

提取不同培養(yǎng)基條件下的發(fā)酵液中脂肽物質(zhì)，冷凍干燥后，配制成不同濃度，檢測其抑菌活性，結(jié)果顯如表2和圖9所示。

從表2可以看出：(1)抑菌圈直徑與提取物濃度呈對數(shù)正相關(guān)。相對而言，低濃度范圍內(nèi)(2.5～5.0 g/L)的增加幅度較大，高濃度范圍的增幅較小。這可能與溶液在培養(yǎng)基中擴散范圍有限有關(guān)。

表2 不同培養(yǎng)基所得脂肽提取物的抑菌活性

圖9 不同培養(yǎng)基中脂肽提取物的抑菌效果擬合曲線

(2)不同培養(yǎng)基所得脂肽提取物在相同濃度下的抑菌活性并不相同。這說明培養(yǎng)基組成不僅影響了抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量，而且改變了抑菌物質(zhì)的種類與比例。相對而言，添加2份離子和5 g/L谷氨酸鈉所得活性抑菌物質(zhì)的含量較高。

(3)菌體在Landy培養(yǎng)基中產(chǎn)生的脂肽提取物總量較少，而且所得產(chǎn)物沒有抑菌活性。這與原發(fā)酵液有抑菌活性不符。推測菌體在該條件下產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)并非脂肽類物質(zhì)，而是在脂肽提取條件(pH為2.0)下失去活性的其他物質(zhì)。

2.4 培養(yǎng)基對抑菌物質(zhì)種類的影響

HPLC檢測結(jié)果顯示(圖10)，貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)共有7個峰，其質(zhì)荷比分別為1 065.79、1 079.91、1 079.96，1 079.95，1 079.92，1 093.98和1 093.98 Da (圖11)。分子量相同，但出峰時間不同的幾個峰可能是其同分異構(gòu)體。

峰1，m/z=1 065.79；峰2，m/z=1 079.91；峰3，m/z=1 079.96；峰4，m/z=1 079.95；峰5，m/z=1 079.92；峰6，m/z=1 093.98；峰7，m/z為1 093.98

圖11 NB和Landy發(fā)酵液中脂肽提取物的物質(zhì)種類

根據(jù)相關(guān)研究[5]，m/z=1 065.79 Da 的脂肽可能是 C14 伊枯草菌素 A(Iturin A)的離子加鈉([M+Na]+)或C17 表面活性素(surfactin)離子加氫([M+H]+)。m/z=1 079和1 093 Da的物質(zhì)是1 065 Da 的同系物，可能分別為C15和C16的 Iturin A6 離子加鈉([M+Na]+)或者surfactin同系物。

對比不同培養(yǎng)基中脂肽提取物的HPLC圖譜可知，Landy培養(yǎng)基所得脂肽物質(zhì)有7種；除1 079.91和1 079.92外，其他組成含量均低于NB培養(yǎng)基。這可能是導(dǎo)致Landy培養(yǎng)基所得發(fā)酵液抑菌活性較低的根本原因。

3 結(jié)論

本文研究了培養(yǎng)基組成對貝萊斯芽孢桿菌代謝合成抑真菌活性物質(zhì)種類和含量的影響，優(yōu)化得到了抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量最高的培養(yǎng)基組成。結(jié)果表明，適合菌體生長的條件并不適用于活性物質(zhì)的產(chǎn)生；只有針對抑菌物質(zhì)的有效合成和活性提高進(jìn)行條件優(yōu)化與過程控制，才能有效提高培養(yǎng)物的整體抑菌活性。同時這說明在生產(chǎn)過程中只強調(diào)芽孢數(shù)量的生產(chǎn)工藝控制并不一定有利于提高產(chǎn)品的整體抑菌活性。本研究所得結(jié)果也可為其他芽孢桿菌發(fā)酵過程研究提供一定的理論參考和實踐依據(jù)。