趙燕,趙保路

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海) 生物工程系，山東 威海，264209) 2(中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，北京，100101)

L-精氨酸具有多種獨(dú)特的生理和藥理作用，包括增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、降低分解代謝、保護(hù)胃腸黏膜等，在臨床營(yíng)養(yǎng)治療中發(fā)揮著重要作用[1-3]。天然抗氧化物劑含有大量能清除過(guò)量自由基的抗氧化成分，具有輔助保護(hù)心血管、降血壓、降血脂、降血糖，以及抑制神經(jīng)退行性疾病等功能[4-5]。例如，銀杏黃酮和知母寧對(duì)心臟缺血再灌注損傷有輔助治療作用[6-9]，山楂黃酮具有輔助緩解中風(fēng)的效果[4]，L-精氨酸、山楂提取物、知母提取物和蝦青素按一定比例混合組成的配方對(duì)心肌梗塞和中風(fēng)有明顯的防治作用[10-11]、對(duì)老年癡呆癥和帕金森病也有明顯延緩作用[12]。

本文重點(diǎn)研究含L-精氨酸和抗氧化物質(zhì)(山楂提取物、知母提取物和蝦青素)組方對(duì)小鼠免疫功能的影響，以期為其臨床應(yīng)用及保健食品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、樣品和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱,德國(guó)Memmert公司;DMIL顯微鏡,德國(guó)徠卡公司;微量注射器、BP211D電子天平,德國(guó)Sartorius公司;UV2550分光光度儀,日本SANYO公司;5702離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣品及試劑

組方樣品由L-精氨酸(L-Arg)、山楂提取物、知母提取物和蝦青素為原料，按質(zhì)量1∶1∶2∶2比例制成。RPMI1640培養(yǎng)液、Hank’s液，賽默飛世爾生物化學(xué)公司；胎牛血清，浙江天航科技有限公司；綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell, SRBC)和雞紅細(xì)胞均由實(shí)驗(yàn)室臨用制備；YAC-細(xì)胞，山東省醫(yī)科院；乳酸鋰、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamade adenine dinucleotide, NAD)、碘硝基氯化四氮唑(iodonitrote trazolium, INT)，阿拉丁試劑公司； 0.2 mol/L tris-HCl緩沖液和Triton試劑，Amresco公司；印度墨汁，索萊寶公司；甲醇、丙酮、鹽酸和異丙醇，天津康科德技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)和處理

SPF級(jí)雄性ICR小鼠，體重18.11～21.99 g(濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司)飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物房，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40～70%，照明時(shí)間12 h。共設(shè)4個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)組小鼠40只，分溶劑對(duì)照組和樣品低、中、高3個(gè)劑量組，每組10只小鼠。免疫一組用于遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)(delayed type hypersensitivity, DTH)實(shí)驗(yàn)、血清溶血素測(cè)定、抗體生成細(xì)胞數(shù)測(cè)定；免疫二組用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；免疫三組用于碳廓清實(shí)驗(yàn)、臟器/體重比值的測(cè)定；免疫四組用于小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.3 劑量選擇及受試物給予方式

L-精氨酸和天然抗氧化劑配方對(duì)人體推薦量為1.6 g/60 kg·BW。動(dòng)物受試物免疫功能實(shí)驗(yàn)劑量按人體推薦的5倍、10倍和30倍3個(gè)劑量，分別為0.133、0.267和0.800 g/kg·BW。稱取樣品，用5 g/L羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)溶液配制，每次灌胃20 ml，對(duì)照組給與同等體積的5 g/L CMC-Na溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法進(jìn)行[13]。DTH采用SRBC誘導(dǎo)小鼠足跖增厚法；ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)采用MTT法；抗體生成細(xì)胞檢測(cè)采用Jeme改良玻片法；血清溶血素測(cè)定采用血凝法；小鼠碳廓清試驗(yàn)和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)采用半體內(nèi)法：NK細(xì)胞活性測(cè)定采用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)測(cè)定法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件以X2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠體重和免疫器官比值的影響

實(shí)驗(yàn)前后各劑量組小鼠體重、脾臟/體重比值及胸腺/體重比值，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),如表1所示。

表1 組方對(duì)小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

注：空白表示無(wú)P值(下同)

2.2 對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

如表2所示，中、高劑量組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.01)，低劑量組無(wú)顯著性差異。而3個(gè)劑量組小鼠的足跖腫脹度與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，本組方對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫功能有顯著增強(qiáng)作用。

表2 組方對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

2.3 對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

3個(gè)劑量組小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)(溶血空斑數(shù))及血清溶血素(半數(shù)溶血值)，與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，如表3所示。依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，本組方對(duì)小鼠的體液免疫功能無(wú)明顯效果。

表3 組方對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

2.4 對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

3個(gè)劑量組小鼠的吞噬雞紅細(xì)胞的百分率和吞噬指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但3個(gè)劑量組小鼠的碳廓清吞噬指數(shù)，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(見(jiàn)表4)。依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，本組方對(duì)小鼠的單核-巨噬細(xì)胞功能有顯著增強(qiáng)的作用。

表4 組方對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

2.5 對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

由表5可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，中和高劑量組的NK細(xì)胞活性均顯著提升(P<0.01)，但低劑量組效果不顯著。依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，本組方對(duì)小鼠的NK細(xì)胞活性有顯著增強(qiáng)的作用。

表5 組方對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

3 討論

L-精氨酸具有重要的營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫功能。精氨酸對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用，主要包括促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫功能。精氨酸-NO的免疫調(diào)控是L-精氨酸發(fā)揮生理功能的重要作用機(jī)制之一。精氨酸通過(guò)兩條代謝途徑參與全身炎癥反應(yīng)：精氨酸酶I和酶Ⅱ途徑，以及過(guò)氧化途徑。L-精氨酸經(jīng)一氧化氮合成酶催化生成具有生物活性的NO。NO在生物體內(nèi)承擔(dān)著重要的生物功能，包括抗炎、降血壓、舒張血管等[14-17]。

山楂的果實(shí)、葉子、花都可入藥，包含多種天然抗氧化物質(zhì)，如黃酮類(lèi)物質(zhì)、原花青素類(lèi)、三萜酸類(lèi)和甾酮類(lèi)等[18]。山楂提取物可通過(guò)抑制磷酸二酯酶活性，增加冠狀動(dòng)脈血液流量和心臟的血液輸出，減少心臟的耗氧量，保護(hù)心臟免受缺血再灌注損傷[19]。它還可用于治療早期充血性心衰、心絞痛、心律不齊、高血壓和高脂血癥[20-21]等。蝦青素屬類(lèi)胡蘿卜素，是存在于魚(yú)、蝦和藻類(lèi)中的一種強(qiáng)抗氧化劑，其抗氧化活性為β-胡蘿卜素的10倍以上、維生素E的100倍以上[22]。知母的有效成分為知母寧，是含有4個(gè)酚羥基的多酚類(lèi)物質(zhì)。知母寧具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥、退熱消炎、抑菌殺菌、降血糖等作用[23-24]。知母寧具有很強(qiáng)清除自由基作用，可降低大鼠心肌缺血再灌注損傷過(guò)程產(chǎn)生的NO自由基和氧自由基，從而緩解心肌缺血再灌注造成的損傷 。

L-精氨酸和天然抗氧化劑有一定的協(xié)同作用，在細(xì)胞和組織體系中，既可以產(chǎn)生一定量的NO，又可以清除氧自由基。另外，NO和天然抗氧化劑對(duì)T-淋巴細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)作用[21,25-29]。L-精氨酸和天然抗氧化劑的組方，既可以降低高脂食物喂養(yǎng)引起大鼠的血脂和血壓的升高，又可以降低轉(zhuǎn)基因小鼠血糖的升高，對(duì)心肌梗塞和中風(fēng)有明顯的防治作用[5,10]，同時(shí)對(duì)老年癡呆癥和帕金森病有明顯的延緩作用[12]。這也為研制和開(kāi)發(fā)保護(hù)血管、防治高血壓、高血脂和高血糖的健康食品和藥物提供了科學(xué)依據(jù)。

本組方由L-精氨酸和天然抗氧化物質(zhì)(山楂提取物、知母提取物和蝦青素)組成，研究結(jié)果顯示該組方(中、高劑量)能顯著提高淋巴細(xì)胞增殖能力和NK細(xì)胞活性(P<0.01)，低、中、高劑量均能顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞百分率及吞噬指數(shù)(P<0.01)。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)判定標(biāo)準(zhǔn)，該組方對(duì)小鼠具有增強(qiáng)免疫功能的作用。