陳靜鈺，黃鑫，王力，王洪新*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(國家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

茶多酚是茶葉中多羥基酚類化合物的統(tǒng)稱，作為茶葉中具有保健功能的主要化學(xué)成分[1-2]，是茶葉深加工的主要產(chǎn)物[3]。隨著歐盟、美國和日本等發(fā)達(dá)國家對食品及農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)的要求日趨嚴(yán)格[4]，茶多酚中的農(nóng)藥殘留也成為了茶葉深加工過程中面臨的主要問題之一，不僅會影響茶多酚產(chǎn)品的質(zhì)量、損害消費(fèi)者健康[5]，而且會損害廠家的品牌聲譽(yù)，影響我國茶葉深加工產(chǎn)品的出口。

吡蟲啉和啶蟲脒是茶葉種植過程中常用的高效氯煙堿類殺蟲劑[6]，在水和有機(jī)溶劑中具有良好的溶解性，因此在茶多酚產(chǎn)品中容易殘留。目前，農(nóng)藥殘留的去除方法主要有物理法、化學(xué)法[7-8]和生物法[9]。其中，化學(xué)法和生物法由于安全性的問題[10-11]，并不適用于茶多酚中農(nóng)藥的去除。在物理方法中，NEZAMADDIN等[12]研究了顆粒狀活性炭對吡蟲啉的吸附性能，發(fā)現(xiàn)吸附行為符合Freundlich等溫吸附模型。ZHAO等[13]將花生殼生物炭用于吸附吡蟲啉，吸附量達(dá)到6 mg/g，且等溫吸附數(shù)據(jù)與Langmuir和Freundlich模型高度相關(guān)。然而，他們?nèi)コr(nóng)殘的作用并不是特異性的。為了達(dá)到最大限度地脫除農(nóng)殘并最大限度的保留產(chǎn)品的活性成分，探索一種對吡蟲啉和啶蟲脒具有高選擇性的材料十分必要。

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinted technique, MIT)是一種結(jié)合高分子化學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科發(fā)展起來的，具備特異性識別功能的新興技術(shù)[14-15]。通過MIT人工合成的具有高穩(wěn)定性、高選擇性等特點(diǎn)的功能性識別材料被稱為分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer, MIP)。迄今為止，MIP已在許多研究中被用于去除有害物質(zhì)。例如，SNCHEZ-POLO[16]成功地合成了能夠從水中脫除四環(huán)素的MIP。同樣地，一種用于吸附釷(Th，IV)的分子印跡固相萃取材料也被研究出來[17]。在吡蟲啉和啶蟲脒的分子印跡研究方面，F(xiàn)AROOQ等[18]合成了用于檢測蘋果汁中吡蟲啉的磁性表面分子印跡材料，材料對樣品的回收率為77.66%～96.57%，顯示了良好的分析性能。KUMAR等[19]將合成的磁性分子印跡材料應(yīng)用于分離蜂蜜和蔬菜樣品中的吡蟲啉，在茄子和蜂蜜樣品中對吡蟲啉的回收率達(dá)到(87.1±5.0)%和(90.6±5.6)%。對于啶蟲脒的分子印跡材料則多見應(yīng)用于電化學(xué)傳感器[20]。然而，這些研究都以檢測為目的進(jìn)行材料的制備和性能研究；其次，目前還沒有應(yīng)用MIP同時(shí)吸附吡蟲啉和啶蟲脒的研究。虛擬模板分子印跡是一種能夠有效避免模板泄漏的技術(shù)[21-22]，在實(shí)際樣品應(yīng)用中，模板泄漏會在分離過程中造成嚴(yán)重的污染。煙酰胺是吡蟲啉和啶蟲脒的結(jié)構(gòu)類似物，具有抗炎作用，常作為食品添加劑、化妝品以及藥物使用，被廣泛認(rèn)為安全性較高[23]。選擇煙酰胺作為虛擬模板，不僅可以同時(shí)對吡蟲啉和啶蟲脒進(jìn)行脫除，還能避免模板泄漏造成的農(nóng)藥污染，提高材料的安全性。本研究以低毒的煙酰胺作為虛擬模板分子，采用分子印跡技術(shù)制備了基于硅膠的虛擬模板表面分子印跡聚合物(dummy template surface molecularly imprinted polymers, DMIP)，并對材料進(jìn)行優(yōu)化，通過吸附實(shí)驗(yàn)考察了其吸附能力，最終成功地應(yīng)用于去除茶多酚溶液中的吡蟲啉和啶蟲脒，為茶提取物中農(nóng)藥殘留的脫除提供了一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吡蟲啉、啶蟲脒、煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁試劑公司；茶多酚，遵義陸圣康源科技有限公司；乙腈(色譜純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，上海泰坦科技股份有限公司；甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈(分析純)，阿拉丁試劑公司；冰醋酸、甲苯、無水Na2SO4、福林酚、Na2CO3、沒食子酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Su1510型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Waters Quattro Premier XE質(zhì)譜儀，美國沃特世公司；YQ型超聲波清洗機(jī)，上海易凈超聲波儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯攪拌水浴鍋，常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 改性硅膠的合成

改性硅膠的合成根據(jù)已有的文獻(xiàn)[24]進(jìn)行了一定的改進(jìn)。將4 g硅膠浸入100 mL的10 mol/L HCl溶液中攪拌24 h，過濾后用去離子水洗滌至中性并干燥。將干燥后的硅膠與50 mL甲苯混合，逐滴滴加6 mL APTS和適量吡啶，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌20 min。將反應(yīng)體系控制在373 K，回流24 h，然后用甲苯、丙酮、乙醚、甲醇對所得混合物進(jìn)行洗滌，最后在真空烘箱中干燥8 h，制備得到氨基改性硅膠。

將4 g氨基改性硅膠與50 mL甲苯混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入8 mL丙烯酰氯，磁力攪拌10 min后逐滴滴加適量的三乙胺，然后在室溫下攪拌24 h。所得化合物經(jīng)甲苯、丙酮、乙醚和甲醇過濾洗滌后，在真空烘箱中干燥8 h，制備得到?；男怨枘z。

1.3.2 分子印跡的合成

稱取123.4 mg(約1 mmoL)煙酰胺置于250 mL圓底燒瓶中，以 80 mL不同比例甲醇-水混合溶解。然后加入適量?；男怨枘z與0.34 mL MAA(4 mmol)并超聲30 min，待充分溶解分散后避光放置4 h，使模板分子與功能單體充分作用。將適量EGDMA和AIBN(40 mg)加入到該混合物中，通高純氮?dú)?0 min，使得瓶內(nèi)保持惰性氛圍，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將燒瓶密封，在333 K水浴下熱引發(fā)聚合24 h。以V(甲醇)∶V(乙酸)=9∶1為溶劑，通過索氏提取法除去模板。所得材料以甲醇洗滌至中性，在323 K下真空干燥6 h，制備得到DMIP。作為對照，在相同條件下不添加模板分子制備了非印跡聚合物(DNIP)。

1.3.3 虛擬模板表面分子印跡制備條件的優(yōu)化

1.3.3.1 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

考察交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比、酰基硅膠的用量以及溶劑的配比3個(gè)因素對DMIP印跡效果的影響，得到單因素的最佳制備條件。

準(zhǔn)確稱取10 mg制備得到的DMIP和DNIP并分別置于25 mL錐形瓶中，然后分別加入8 mL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的吡蟲啉和0.2 mg/mL啶蟲脒混合水溶液。在室溫下?lián)u晃20 h后，離心取上清液，并用去離子水稀釋至4 mL。采用HPLC-MS-MS法測定上清液中的吡蟲啉和啶蟲脒的濃度，計(jì)算吸附容量Q(mg/g)和特異因子α，計(jì)算方法如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：ρ0，初始質(zhì)量濃度，g/mL；ρt，平衡質(zhì)量濃度，g/mL；V，溶液體積，mL；m，材料質(zhì)量，mg。Qm，DMIP的吸附容量，mg/g；Qn，DNIP的吸附容量，mg/g。

最終的QDMIP為 DMIP對吡蟲啉和啶蟲脒吸附容量的平均值。

1.3.3.2 分子印跡聚合物制備條件響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比(A)、?；枘z的用量(B)、溶劑的配比(C)為實(shí)驗(yàn)因素，以虛擬模板表面分子印跡的吸附容量QDMIP(mg/g)和特異因子α為響應(yīng)值，利用軟件Design-Expert對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.4 分子印跡的掃描電鏡表征

稱取DMIP和DNIP粉末適量，粘于導(dǎo)電膠上并鍍金，用掃描電鏡觀察樣品形態(tài)。

1.3.5 分子印跡的吸附性能研究

準(zhǔn)確稱取200 mg的DMIP和DNIP分別置于250 mL錐形瓶中，然后分別加入50 mL的0.2 mg/mL吡蟲啉和0.2 mg/mL啶蟲脒混合水溶液。在室溫下?lián)u動5、30、90、150、210、270、330和390 min后，取0.15 mL混合溶液離心并取上清液，用去離子水稀釋至4 mL。采用HPLC-MS-MS法測定上清液中吡蟲啉和啶蟲脒的濃度，計(jì)算吸附容量。

1.3.6 分子印跡應(yīng)用于脫除茶多酚中的吡蟲啉和啶蟲脒

將100 mg DMIP通過濕法裝柱填充到固相萃取柱中，加入10 mL甲醇進(jìn)行活化備用。將50 mL的20 mg/mL茶多酚溶液中添加10 μg/mL吡蟲啉和啶蟲脒，作為上樣液進(jìn)行固相萃取，樣液的流速控制在1.25 mL/min。之后，用10 mL去離子水洗去弱保留化合物，合并洗脫液，用HPLC-MS-MS測定洗脫液中茶多酚、吡蟲啉和啶蟲脒的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 虛擬模板表面分子印跡制備條件的優(yōu)化

2.1.1 交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比對分子印跡材料印跡效果的影響

交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比能夠影響分子特異性吸附位點(diǎn)的數(shù)量，從而影響其吸附效果。將QDMIP和α作為指標(biāo)，對交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比對分子印跡效果的影響進(jìn)行考察，結(jié)果如表1所示。

表1 交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比對分子印跡效果的影響

由結(jié)果可知，若要QDMIP和α達(dá)到最優(yōu)的條件，交聯(lián)劑與功能單體用量的摩爾比為7∶1。這可能是因?yàn)樵诮宦?lián)劑的添加量較少時(shí)，分子印跡聚合物的交聯(lián)度較低，以至于不能夠充分固定功能單體和模板分子，難以形成足夠的排列有序的空間位點(diǎn)；而當(dāng)交聯(lián)劑的添加量太多時(shí)，分子印跡聚合物的交聯(lián)度較高，單位質(zhì)量的聚合物中產(chǎn)生的特異性識別孔穴較少，因此也會對材料的印跡效果造成影響。

2.1.2 酰基硅膠的用量對分子印跡材料印跡效果的影響

改性硅膠的用量會對分子印跡聚合物的吸附效果產(chǎn)生很大的影響。若改性硅膠的用量過少，則會導(dǎo)致有一部分的模板分子和功能單體不能在改性硅膠的表面聚合，從而使得印跡層的厚度較大，影響特異性吸附效果；當(dāng)改性硅膠的用量過多時(shí)，不僅會導(dǎo)致硅膠顆粒發(fā)生團(tuán)聚，而且會使得硅膠表面的印跡層過薄，從而使得單位質(zhì)量聚合物中的有效印跡位點(diǎn)減少。將QDMIP和α作為指標(biāo)，對酰基硅膠的用量對分子印跡效果的影響進(jìn)行考察，結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，?；男怨枘z的最佳用量是0.9 g，此時(shí)QDMIP和α達(dá)到最優(yōu)。

表2 ?；枘z的用量對分子印跡效果的影響

2.1.3 溶劑的配比對分子印跡材料印跡效果的影響

含水體系的極性溶劑可以有效地增加分子印跡聚合物在水相中的識別性能。將QDMIP和α作為指標(biāo)，對溶劑中甲醇和水的配比對分子印跡效果的影響進(jìn)行考察，結(jié)果如表3所示。

表3 溶劑的配比對分子印跡效果的影響

結(jié)果顯示，當(dāng)溶劑中甲醇與水的配比為90∶10時(shí)，QDMIP和α達(dá)到最優(yōu)。這可能是因?yàn)樘砑舆m量的水可以增加MAA與模板分子靜電和疏水作用，從而增強(qiáng)其在水相中的特異性識別能力；然而當(dāng)溶劑中水的含量過多時(shí)，則會嚴(yán)重干擾模板分子和功能單體之間氫鍵的形成。

2.1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

虛擬模板表面分子印跡制備優(yōu)化的響應(yīng)面分析結(jié)果見表4。采用Design-Expert對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，方差分析的結(jié)果見表5及表6。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

結(jié)合2個(gè)回歸模型方程，采用Design-Expert 8.0繪制了響應(yīng)面分析圖，見圖1。結(jié)果表明，交聯(lián)劑與功能單體用量比和?；枘z用量、改性硅膠用量和溶劑配比3個(gè)因素互相的交互作用都會對DMIP的吸附容量QDMIP以及選擇因子α產(chǎn)生明顯的影響。結(jié)合2個(gè)模型，通過軟件分析，最終得到DMIP的最佳制備條件為：交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾7.05∶1，改性硅膠用量0.919 mg, 溶劑中甲醇/水的體積比為90.13∶9.87。

表5 回歸模型各項(xiàng)方差分析(QDMIP為響應(yīng)值)

表6 回歸模型各項(xiàng)方差分析(α為響應(yīng)值)

2.2 分子印跡的掃描電鏡表征

圖2為DMIP和DNIP的掃描電鏡圖像。將圖2-a、圖2-b與圖2-c、圖2-d相比，可以明顯看出DMIP呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀的分支結(jié)構(gòu)，與DNIP相比更加的疏松多孔，且有明顯的結(jié)塊現(xiàn)象。這是由于DMIP在制備的過程中加入了煙酰胺作為虛擬模板分子，模板分子被洗脫之后留下了與對應(yīng)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)，這些空間結(jié)構(gòu)使得DMIP看起來更加粗糙蓬松。在DNIP表面鑲嵌有硅膠顆粒，這也說明材料的聚合過程是在硅膠的表面進(jìn)行的。

2.3 分子印跡的吸附性能研究

如圖3所示，DMIP和DNIP對吡蟲啉和啶蟲脒的吸附量皆隨著吸附時(shí)間的增加而增加。在前90 min，DMIP和DNIP對吡蟲啉和啶蟲脒的吸附速率較快，在210 min之后基本達(dá)到吸附平衡，說明該表面印跡材料對吡蟲啉和啶蟲脒具有較大的吸附動力學(xué)。這是由于所制備的表面分子印跡的吸附位點(diǎn)基本位于材料表面，在吸附過程中能夠更加快速高效地和底物接觸。與此同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，雖然具有相似的吸附趨勢，但是DMIP吡蟲啉和啶蟲脒的吸附量比DNIP大得多，這是由于虛擬模板分子在DMIP表面上產(chǎn)生了特異性吸附位點(diǎn)，使得吡蟲啉和啶蟲脒更容易進(jìn)入。

圖1 各因素的交互作用對QDMIP和α的響應(yīng)面分析圖

放大倍數(shù)(a，c)15 000，(b，d)5 000

a-吡蟲啉;b-啶蟲脒

2.4 分子印跡脫除茶多酚中的吡蟲啉和啶蟲脒

將所制備的DMIP材料用于從茶多酚中去除吡蟲啉和啶蟲脒。將50 mL上樣溶液經(jīng)過DMIP柱，再用10 mL去離子水過柱，合并流出液。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS-MS)和紫外可見分光光度計(jì)(UV-visible)分別測定了2種農(nóng)藥和茶多酚的含量。結(jié)果表明，經(jīng)過DMIP柱后，上樣液中吡蟲啉和啶蟲脒的濃度均顯著下降。通過3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)測定可知，該柱對吡蟲啉和啶蟲脒的去除率分別為96.2%和95.6%，而對茶多酚的吸附率僅為3.7%，遠(yuǎn)低于2種農(nóng)藥的吸附率。結(jié)果表明，DMIP材料對茶多酚溶液中的吡蟲啉和啶蟲脒具有選擇性吸附能力，有望應(yīng)用于在茶多酚生產(chǎn)工藝中去除殘留的吡蟲啉和啶蟲脒。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以硅膠為基底、煙酰胺為虛擬模板分子，采用表面印跡法制備了能夠特異性吸附吡蟲啉和啶蟲脒的表面分子印跡聚合物。選用無毒的煙酰胺作為虛擬模板，不僅避免模板滲漏和污染，而且可以為吡蟲啉和啶蟲脒提供吸附位點(diǎn)。通過單因素實(shí)驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法對DMIP的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，得到DMIP的最佳制備條件為：交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比為7.05∶1，改性硅膠用量0.919 mg, 溶劑中甲醇/水的體積比90.13∶9.87，并且對優(yōu)化后DMIP的吸附性能進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明，優(yōu)化后的DMIP對吡蟲啉和啶蟲脒具有良好的吸附性能和選擇性，對吡蟲啉和啶蟲脒的最大吸附量分別為41.73和21.95 mg/g，與其他種類的分子印跡材料相比具有一定的優(yōu)勢[18-19]，適合作為吸附材料使用。此外，該聚合物還成功地作為柱填料同時(shí)去除茶多酚中的吡蟲啉和啶蟲脒，對吡蟲啉和啶蟲脒的脫除率分別達(dá)到96.2%和95.6%，對茶多酚的吸附率僅為3.7%。因此，該材料有望用于茶提取物中吡蟲啉和啶蟲脒的脫除中，可以進(jìn)一步研究DMIP的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及重復(fù)利用性，以期更好地用于工業(yè)化生產(chǎn)。