尹小慶，湯艷燕，闞建全, 武亞婷，武運(yùn)，杜木英*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(中匈食品科學(xué)合作研究中心，重慶，400715)3(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊，830052)

鲊?yán)苯罚址Q(chēng)鲊海椒、鲊廣椒、酢辣椒、包谷酸辣子等，是我國(guó)西南地區(qū)的一種傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品。鲊?yán)苯肥且怎r辣椒、玉米粉或大米粉為主要原料，添加生姜、食鹽等輔料，經(jīng)破碎混勻后于密閉容器中進(jìn)行自然發(fā)酵而成。

風(fēng)味物質(zhì)分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，非揮發(fā)性風(fēng)味是能引起酸、甜、咸、苦、鮮等味覺(jué)感受的物質(zhì)。發(fā)酵辣椒中的有機(jī)酸主要為乳酸菌發(fā)酵所產(chǎn)生，以乳酸含量最高[1]。辣椒素類(lèi)為辣椒本身所含有，賦予了鲊?yán)苯返睦蔽禰2]。氨基酸類(lèi)來(lái)源于辣椒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的微生物，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生，是鲊?yán)苯孵r味的來(lái)源。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是能被嗅覺(jué)所感觸到的呈香物質(zhì)，包括醛類(lèi)、內(nèi)酯、酮類(lèi)以及萜烯類(lèi)等[3]。微生物在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生起到關(guān)鍵作用，PANG等[4]發(fā)現(xiàn)清香型白酒中的耐酸乳桿菌與短鏈酯類(lèi)物質(zhì)呈正相關(guān)，短乳桿菌與長(zhǎng)鏈酯類(lèi)物質(zhì)呈正相關(guān)。XIE等[5]研究表明，不同腐乳中乳酸乳球菌、鞘氨醇桿菌屬、發(fā)酵畢赤酵母、奧默柯達(dá)酵母和魯氏酵母是潛在的產(chǎn)香微生物。

目前，小米辣鲊?yán)苯返莫?dú)特風(fēng)味物質(zhì)和微生物多樣性變化規(guī)律在發(fā)酵過(guò)程中的變化未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以不同發(fā)酵階段的小米辣鲊?yán)苯窞檠芯繉?duì)象，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)酸、氨基酸含量和風(fēng)味物質(zhì)變化進(jìn)行分析，并采用MiSeq高通量測(cè)序研究小米辣鲊?yán)苯分形⑸锏亩鄻有?，揭示小米辣鲊?yán)苯分酗L(fēng)味物質(zhì)和微生物的變化，為小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)和微生物多樣性的變化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：按傳統(tǒng)工藝制作[6]。取發(fā)酵時(shí)間為0、7、15、22、30、45、60、90 d的小米椒鲊?yán)苯罚幪?hào)為A1～A8。

試劑：草酸、乙酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸(標(biāo)準(zhǔn)品)，索萊寶生物科技有限公司；磷酸、5-磺基水楊酸、甲醇(分析純)，成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC-20高效液相色譜儀，日本島津公司；100 μm PDMS固相微萃取(SPME)裝置，美國(guó)supelco公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司；JA2003分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)性成分的測(cè)定

(1)萃取方法[7]：稱(chēng)取5 g樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，再加入10 μL 2-辛醇(500 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)，加蓋密封。在50 ℃恒溫水浴平衡30 min后，將老化后的萃取頭(100 μm PDMS)插入頂空進(jìn)樣瓶中，頂空吸附40 min，然后在GC-MS進(jìn)樣器中解析5 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器。

(2)測(cè)定條件：色譜和質(zhì)譜條件參考尹小慶等[8]的方法。

(3)定性及定量分析：采用NIST05、NIST08等譜庫(kù)檢索(匹配度<80的化合物)和保留指數(shù)結(jié)合進(jìn)行定性分析。樣品中各揮發(fā)性組分的絕對(duì)含量按公式(1)計(jì)算[9]：

(1)

式中：ρ，內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度，μg/μL；V，內(nèi)標(biāo)物體積，μL；Ai，各揮發(fā)性組分的峰面積；A，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積；m，樣品的質(zhì)量，kg。

1.3.2 有機(jī)酸含量的測(cè)定[10]

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：將質(zhì)量濃度范圍為0.02～4.08 g/L的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析，以質(zhì)量濃度X(g/L)對(duì)峰面積Y做圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

表1 有機(jī)酸的保留時(shí)間與回歸方程

(2)色譜條件：使用AgilentC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)1%甲醇：0.06 mol/L的KH2PO4(用H3PO4調(diào)pH至2.50)；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量15 μL；柱溫28 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

(3)樣品前處理及定性定量分析：稱(chēng)取 2.5 g左右樣品，加純水于75 ℃水浴20 min，冷卻后定容至50 mL，8 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析。采用保留時(shí)間定性，以峰面積外標(biāo)法定量。

1.3.3 游離氨基酸的測(cè)定[11]

(1)樣品前處理：稱(chēng)取0.2 g左右樣品，然后加入2 mL 40 g/L的磺基水楊酸充分振蕩，在4 ℃冰箱放置過(guò)夜，8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

(2)測(cè)定條件：柱溫50 ℃；反應(yīng)器溫度135 ℃；進(jìn)樣量20 μL；泵1流速0.4 mL/min；泵2流速0.35 mL/min。

1.3.4 微生物群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定

(1)基因組DNA提取：參照E.Z.N.A Soil DNA kit說(shuō)明書(shū)，提取鲊?yán)苯分锌偦蚪MDNA。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。

(2)PCR擴(kuò)增：對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)真菌的 ITS1-ITS2可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，具體引物見(jiàn)表2。優(yōu)化PCR體系和反應(yīng)條件，將所有樣品的微生物宏基因組在此條件下進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。

表2 細(xì)菌和真菌的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

細(xì)菌PCR反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L上游引物和下游引物各0.8 μL，4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA, 模板DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。細(xì)菌PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(27 個(gè)循環(huán))，最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫。

真菌PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L上游引物和下游引物各0.8 μL，0.2 μL rTaq Polymerase，0.2 μL BSA, 10 ng模板DNA，補(bǔ)ddH2O至20 μL。真菌PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s(35 個(gè)循環(huán))，最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫。

擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

(3)MiSeq高通量測(cè)序：將PCR產(chǎn)物純化后定量，并按照每個(gè)樣本測(cè)序量的要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，構(gòu)建文庫(kù)，然后進(jìn)行MiSeq測(cè)序。

(4)生物信息學(xué)分析：Illumina平臺(tái)測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，需對(duì)所得序列進(jìn)行拼接及質(zhì)控過(guò)濾。根據(jù)條碼將序列確定到每個(gè)樣品，并將條碼、載體序列和引物序列去除，去掉長(zhǎng)度<200 bp、單堿基重復(fù)>6個(gè)、含2個(gè)以上錯(cuò)配的引物堿基以及含模糊堿基的序列，得到有效的序列文件[12]。在97%的相似水平下對(duì)所有序列進(jìn)行操作分類(lèi)單位(operational taxonomic unit, OTU)劃分并與 Silva、Unite等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用Mothur軟件進(jìn)行OTU分布統(tǒng)計(jì)以及分類(lèi)學(xué)分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米辣鲊?yán)苯分袚]發(fā)性成分的分析

小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分的種類(lèi)及含量見(jiàn)表3所示，共檢出66種揮發(fā)性成分，其中酯類(lèi)28種，萜類(lèi)17種，烷烴類(lèi)13種，醇類(lèi)和醛類(lèi)各3種，酸類(lèi)和吡嗪類(lèi)各1種。總揮發(fā)成分的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，各類(lèi)揮發(fā)性化合物的含量變化趨勢(shì)與總揮發(fā)性含量大致相同。在發(fā)酵45 d時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)和含量均達(dá)到最大值。小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中香氣活度值(odor activity value, OAV)>1的揮發(fā)性成分共19種，見(jiàn)表4所示。其中，酯類(lèi)13種、萜類(lèi)4種、醇類(lèi)和吡嗪類(lèi)各1種。在不同的發(fā)酵階段，小米鲊?yán)苯返闹饕卣黠L(fēng)味物質(zhì)差異較大。

酯類(lèi)化合物主要賦予食品特殊的水果香味[13]。直鏈酯類(lèi)是以脂肪酸為前體物質(zhì)，經(jīng)脂肪酸的氧化代謝而形成的香氣物質(zhì)，支鏈酯類(lèi)香氣物質(zhì)主要來(lái)源于氨基酸的代謝，而芳香環(huán)類(lèi)香氣物質(zhì)則由苯丙氨酸經(jīng)莽草酸途徑合成[14-15]。在發(fā)酵0 d 時(shí)，酯類(lèi)化合物共16種，其中己酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、異丁酸己酯、苯甲酸乙酯、己酸己酯和(Z)-4-癸烯酸乙酯的OAV>1，說(shuō)明它們對(duì)鮮小米辣的香氣有一定貢獻(xiàn)。發(fā)酵22 d后，OAV>1的物質(zhì)有11種，己酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯等OVA值相對(duì)較高。小米辣鲊?yán)苯分絮ヮ?lèi)化合物的種類(lèi)和含量在發(fā)酵45 d時(shí)達(dá)最大值。發(fā)酵45～60 d的小米辣檢出13種對(duì)風(fēng)味有貢獻(xiàn)的酯類(lèi)化合物，其中丁酸乙酯具有強(qiáng)烈的菠蘿香氣，己酸乙酯有強(qiáng)烈的甜果香，乙酸己酯具有青香和果香[16]，且這3種酯類(lèi)OAV>100，是鲊?yán)苯诽卣飨銡獬煞帧?/p>

萜類(lèi)化合物對(duì)天然風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)。小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵前15 d僅檢出(Z)-β-羅勒烯、芳樟醇、(-)-α-蓽澄茄油烯、β-欖香烯、α-雪松烯和β-石竹烯，而α-柏木烯和α-姜黃烯在發(fā)酵15 d后生成，其余萜類(lèi)物質(zhì)直至發(fā)酵30 d后才檢出。小米辣鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵45 d時(shí)萜類(lèi)化合物的種類(lèi)和含量最高，發(fā)酵45～60 d時(shí)OAV>1的萜類(lèi)化合物有4種。其中芳樟醇具有漿果和玫瑰香氣，是小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵 45～60 d時(shí)共有的特征香氣物質(zhì)。

表3 小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分的變化

續(xù)表3

序號(hào)物質(zhì)保留指數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)含量/(μg·kg-1)0 d7 d15 d22 d30 d45 d60 d90 d47α-雪松烯1 48830.90282.043 464.154 943.835 750.4715 750.4110 810.482 658.4748β-石竹烯1 49274.2993.54175.70313.72555.991 237.392413.45102.2849α-愈創(chuàng)木烯1 507ndndnd87.97499.431 271.6885.9324.5850β-雪松烯1 511ndndnd51.38499.43981.441 852.1156.6451α-姜黃烯1 519ndnd176.95316.95430.131 233.911 253.53143.4652柏木腦1 617ndndndnd603.231 141.21960.03236.38532-甲氧基-3-異丁基吡嗪1 199ndndndnd21.9486.24102.2720.19543-甲基十一烷1 175ndndndnd59.31295.76237.1562.62552-甲基十三烷1 3611 097.461 267.85990.771 679.401 567.204 634.804 603.24693.0156正十四烷1 402171.74441.77165.57244.14296.21771.05825.53164.40572-甲基四癸烷1 4621 168.221 455.161 156.001 891.702 039.834 015.097 239.40740.5758正十五烷1 505500.57827.82255.41429.90533.801 271.681 352.67256.79592-甲基十五烷1 544ndndndnd89.18161.09131.2241.3660正十六烷1 603ndnd275.47460.35531.741 258.491 275.29303.2661姥鮫烷1 646ndndndnd134.54255.68308.86174.51622-甲基二六烷1 663263.351 545.9879.85139.98222.95566.76511.82104.8663正十七烷1 700ndnd198.77329.06432.131 186.671 217.65238.5264植烷1 742ndndndnd73.67350.62141.0360.85653-甲基十七烷1 771ndndndnd52.4355.9889.9252.5566正十八烷1 806ndnd55.0591.68103.67262.29230.7582.93

注：nd表示未檢出(下同)

表4 小米辣鲊?yán)苯分兄饕煞值腛AV

注：表4中序號(hào)與表3中序號(hào)相對(duì)應(yīng)

醇類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)和吡嗪類(lèi)化合物均在發(fā)酵30 d后生成，且含量較低。2-甲氧基-3-異丁基吡嗪具有類(lèi)似胡椒和咖啡的香氣，是青辣椒的主要香氣成分[17]。雖然其含量低，但由于閾值僅為0.016 μg/kg，且OAV>1 000，所以是小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵30 d后的特征香氣成分。研究表明,辣椒變紅后2-甲氧基-3-異丁基吡嗪含量降低[18]，這可能是鲊?yán)苯钒l(fā)酵前22 d未檢測(cè)到2-甲氧基-3-異丁基吡嗪的原因。而在發(fā)酵后期能檢測(cè)到這種物質(zhì)是因?yàn)榘l(fā)生strecker反應(yīng)，生成吡嗪類(lèi)物質(zhì)[19]。

烴類(lèi)化合物的風(fēng)味閾值高，對(duì)小米辣鲊?yán)苯返娘L(fēng)味貢獻(xiàn)小，所以烴類(lèi)化合物不是鲊?yán)苯返奶卣飨銡獬煞帧０l(fā)酵前7 d，小米辣鲊?yán)苯分兄饕酋ヮ?lèi)和烷烴類(lèi)化合物，分別占總含量的45%左右。發(fā)酵15 d后，各類(lèi)化合物含量增加但比例發(fā)生了變化，萜類(lèi)化合物上升至30%以上，烷烴類(lèi)化合物下降在到20%左右，酯類(lèi)維持在40%左右。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，烷烴化合物在向萜類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，酯類(lèi)和萜類(lèi)逐漸成為小米辣鲊?yán)苯返闹饕銡獬煞帧?/p>

2.2 小米辣鲊?yán)苯分杏袡C(jī)酸的動(dòng)態(tài)變化

由表5可知，小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的總量呈先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵22 d時(shí)有機(jī)酸總含量最高，為14.56 g/kg。酸味是鲊?yán)苯返囊粋€(gè)非常重要的滋味品質(zhì)，但不同的有機(jī)酸有不同的酸味特征[21]。蘋(píng)果酸具有溫和的酸味，酒石酸具有葡萄和白檸檬的香氣，這2種酸在發(fā)酵過(guò)程中逐漸增加，在第30天達(dá)到最大值，分別為1.14和1.98 g/kg，然后基本保持不變。乳酸的酸味柔和，有后酸味。在發(fā)酵前22 d，乳酸含量不斷增加，而22 d后，乳酸含量略微下降后保持相對(duì)穩(wěn)定。琥珀酸有豆醬類(lèi)的風(fēng)味，在發(fā)酵22 d后含量大幅度減少直至低于檢測(cè)限。而乙酸的酸味有刺激性，但蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸能夠中和乙酸的刺激性，使酸味更加柔和、醇厚[22]。在發(fā)酵22 d后，乙酸含量急劇減少，推測(cè)乙酸與醇類(lèi)等物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)[23]，進(jìn)而增加了鲊?yán)苯返娘L(fēng)味。

表5 小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 小米辣鲊?yán)苯分杏坞x氨基酸的分析

氨基酸不僅具有營(yíng)養(yǎng)功能，而且還是重要的呈味物質(zhì)。如Asp和Glu是鮮味氨基酸，His、Leu和Tyr味道微苦。這些氨基酸不僅可以組成不同形式的滋味相關(guān)肽，還可能對(duì)醇、酯等芳香成分產(chǎn)生一定影響[24]。由表6可知，發(fā)酵0 d時(shí)，小米辣鲊?yán)苯返目偘被岷繛?.31 g/kg，苦味、甜味、鮮味和無(wú)味氨基酸分別占總含量的14.4%、78.03%、3.37%和4.2%，必需氨基酸占比11.9%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總氨基酸和甜味氨基酸含量降低，苦味、鮮味、無(wú)味和必需氨基酸含量增加。其中His、Arg、Ser和Cys含量降低，其余氨基酸含量逐漸增加。發(fā)酵45 d時(shí)，小米辣鲊?yán)苯返目偘被岷肯陆档?.33 g/kg，必需氨基酸占比為上升到46.21%?？辔丁⑻鹞?、鮮味和無(wú)味氨基酸分別占總含量的43.27%、28.03%、15.32%和13.38%，可見(jiàn)氨基酸的滋味逐漸豐富。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，7種必需氨基酸含量不斷增加，發(fā)酵45 d后必需氨基酸的含量占總含量的45%以上，說(shuō)明小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵45 d后營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

表6 小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的變化

續(xù)表6

物質(zhì)游離氨基酸含量/(g·kg-1)0 d7 d15 d22 d30 d45 d60 d90 d亮氨酸(Leu)241.17 240.46 375.91 343.99 357.57 356.24 388.86 392.39異亮氨酸(Ile)96.73 95.44 145.20 136.24 143.35 166.21 181.73 182.32 甲硫氨酸(Met)68.53 68.67 98.31 91.18 94.79 97.77 104.76 106.54 酪氨酸(Tyr)133.99 147.16 195.81 166.98 178.16 222.07 227.89 232.82 甜味6 486.84 5 350.57 4 171.95 2 994.26 2 064.73 934.38 1 034.95 1 016.73 絲氨酸(Ser)5 977.01 4 820.69 3 458.68 2 330.70 1 388.62 238.37 262.66 262.44 蘇氨酸(Thr)87.66 78.29 115.65 99.36 103.52 133.44 144.82 140.02 甘氨酸(Gly)93.12 96.92 135.53 117.30 124.13 131.82 143.33 143.08 丙氨酸(Ala)329.05 354.66 462.08 446.89 448.46 430.75 484.14 471.19 鮮味280.17 291.37 411.19 364.44 393.17 510.84 540.67 550.56 天冬氨酸(Asp)33.00 39.84 55.47 64.32 78.87 131.80 128.27 133.77 谷氨酸(Glu)247.17 251.52 355.72 300.12 314.30 379.03 412.40 416.79 無(wú)味349.09 337.85 485.56 412.51 433.20 446.14 482.79 478.43 賴(lài)氨酸(Lys)163.96 147.39 207.77 187.51 197.33 208.04 229.34 227.09 半胱氨酸(Cys)9.61 9.13 7.17 12.04 12.49 6.21 7.50 7.29 脯氨酸(Pro)175.52 181.33 270.63 212.96 223.38 231.88 245.95 244.05 必需氨基酸988.91 989.75 1 441.65 1 305.36 1 364.66 1 540.64 1 651.84 1 667.30 總計(jì)8 313.00 6 967.00 6 414.16 4 994.26 4 167.13 3 333.83 3 602.39 3 607.85

2.4 小米辣鲊?yán)苯分形⑸锒鄻有缘姆治?/h3>

2.4.1 發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中共鑒定出30種不同屬的細(xì)菌，如圖1所示。

圖1 小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌在屬水平上的群落熱圖

相對(duì)豐度>0.1%的有11種，如乳桿菌屬(Lactobacillus)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacterianorank)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Lactobacillus的相對(duì)豐度呈先增加后減少的趨勢(shì)，這與乳酸含量在發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)基本一致。發(fā)酵15 d后乳桿菌屬豐度迅速增加到64.69%，發(fā)酵30～60 d，Lactobacillus的豐度保持在80%左右。盡管在發(fā)酵90 d后，Lactobacillus含量降低到57.47%，也依然是小米辣鲊?yán)苯分械膬?yōu)勢(shì)菌群。周俊良[25]分離鑒定了辣椒制品中10種乳酸菌，其中7種為乳桿菌。韓俊燕等[26]發(fā)酵辣椒細(xì)菌多樣性的研究也表明乳桿菌是發(fā)酵辣椒的主要菌屬。發(fā)酵90 d后仍有26個(gè)細(xì)菌屬參與發(fā)酵，其中約20個(gè)細(xì)菌屬參與了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程?？梢?jiàn)，在小米辣鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵過(guò)程中保持了細(xì)菌的多樣性。

2.4.2 發(fā)酵過(guò)程中真菌群落結(jié)構(gòu)分析

小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中共鑒定出36種不同屬的真菌，如圖2所示。發(fā)酵0 d時(shí)，其中相對(duì)豐度>0.1%的菌屬有Candida(97.44%)、Aspergillus(0.44%)、unclassifiedColletotrichum(0.34%)、Meyerozyma(0.26%)、Colletotrichum(0.24%)、Fusarium(0.19%)、Gibberella(0.15%)、Meyerozyma(0.11%)、Monographella(0.10%)、unclassifiedDavidiellaceae(0.1%)。假絲酵母屬(Candida)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度>97%，為小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌。劉麗娜[27]研究發(fā)現(xiàn)石柱辣椒表面的酵母菌以假絲酵母居多，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類(lèi)似。發(fā)酵7 d后真菌屬的種類(lèi)銳減到10個(gè)左右，可能是因?yàn)槿樗峋趨捬醢l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸，高酸性環(huán)境影響了一些真菌正常的生長(zhǎng)代謝。且除Candida以外，其他真菌屬的含量均低于0.1%。推測(cè)Meyerozyma、Kazachstania參與了鲊?yán)苯氛麄€(gè)發(fā)酵過(guò)程。

圖2 小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中真菌在屬水平上的群落熱圖

2.5 風(fēng)味物質(zhì)與微生物相關(guān)性分析

為研究微生物與揮發(fā)性成分之間的關(guān)系，分析了小米辣鲊?yán)苯凡煌l(fā)酵階段微生物(相對(duì)豐度>1%)群落的相對(duì)豐度與66種揮發(fā)性成分含量之間的相關(guān)性。由表7可知，Lactobacillus與47種揮發(fā)性化合物顯著相關(guān)(P<0.05)，其中包括13種小米辣鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵過(guò)程中的特征香氣成分，酯類(lèi)10種、萜類(lèi)2種、吡嗪類(lèi)1種。并且Lactobacillus與其中21種揮發(fā)性化合物相關(guān)性極顯著(P<0.01)，其中乙酸己酯、庚酸乙酯、異丁酸乙酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇、β-石竹烯為小米辣鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵過(guò)程中的特征香氣成分。Candida與27種化合物顯著相關(guān)(P<0.05)，包括酯類(lèi)14種、萜類(lèi)6種、醇類(lèi)2種、醛、酸類(lèi)各1種、烷烴類(lèi)3種，其中乙酸戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯、β-石竹烯小米辣鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵過(guò)程中的特征香氣成分。乳桿菌屬和Candida均與特征香氣成分乙酸戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯、β-石竹烯有顯著相關(guān)性?？梢?jiàn)，Lactobacillus和Candida對(duì)小米辣鲊?yán)苯废銡庑纬善鹬匾饔谩?/p>

3 結(jié)論

小米辣鲊?yán)苯吩谡麄€(gè)發(fā)酵過(guò)程中，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、有機(jī)酸和游離氨基酸在不同發(fā)酵階段差異較大。小米辣鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵過(guò)程中共檢出 66 種揮發(fā)性化合物，各類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)含量均先增加后減少，其中醇類(lèi)在發(fā)酵30 d時(shí)達(dá)最大值，酯、萜、醛及酸類(lèi)物質(zhì)在發(fā)酵45 d時(shí)達(dá)最大值，吡嗪和烷烴類(lèi)在發(fā)酵60 d時(shí)達(dá)最大值。丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、芳樟醇和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪是小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵45～60 d時(shí)的特征香氣成分。小米辣鲊?yán)苯分泄矙z測(cè)出 6 種有機(jī)酸，琥珀酸和乙酸含量先升高后降低，其余有機(jī)酸含量先增加后基本保持穩(wěn)定。小米辣鲊?yán)苯分泄矙z測(cè)出 18種氨基酸，其總量不斷降低，但人體必需氨基酸含量由11.9%增加至46.21%。小米辣鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵中共鑒定出30個(gè)細(xì)菌屬、36個(gè)真菌屬，其中Lactobacillu和Candida為發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群。Lactobacillus與47種揮發(fā)性成分顯著相關(guān)(P<0.05)，且與特征香氣成分乙酸己酯、庚酸乙酯、異丁酸乙酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇、β-石竹烯相關(guān)性極顯著(P<0.01)。Candida與27種化合物顯著相關(guān)(P<0.05)，包括酯類(lèi)14種、萜類(lèi)6種、醇類(lèi)2種、醛、酸類(lèi)各1種、烷烴類(lèi)3種。該結(jié)果將為小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)和微生物多樣性的變化提供理論依據(jù)。

表7 小米辣鲊?yán)苯分形⑸锱c揮發(fā)性物質(zhì)的Spearman相關(guān)系數(shù)

注：表7中序號(hào)與表3中序號(hào)相對(duì)應(yīng)。*表示相關(guān)性顯著(P<0.05)；**表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)