陳晨，孫倩

原人參二醇納米混懸液體外含量測(cè)定及凍干保護(hù)劑的研究

陳晨，孫倩

（遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110101）

20（S）-原人參二醇作為研究對(duì)象，用反溶劑沉淀法制備20（S）-原人參二醇納米混懸液。通過(guò)優(yōu)化液相的條件，本章建立了原人參二醇HPLC的體外分析方法，確定了乙腈∶水（/）=90∶10（/）作為流動(dòng)相，波長(zhǎng) 210 nm 的液相條件。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密度和準(zhǔn)確度的考察結(jié)果顯示：原人參二醇在23.08~1 154 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，日內(nèi)、日間精密度RSD值小于3%，準(zhǔn)確度在96%~103%之間，加樣回收率為100.84%，該方法滿足體外檢測(cè)原人參二醇定量的要求。考察凍干保護(hù)劑，最后確定為1.5%的羥丙基-β-環(huán)糊精。

原人參二醇； 含量測(cè)定； 凍干保護(hù)劑

人參是五加科植物人參屬人參的干燥根莖，在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，最早記錄于我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)專著《神農(nóng)百草經(jīng)》[1, 2]。人參中有多種有效的化學(xué)成分，如皂苷、氨基酸揮發(fā)油及多糖等，其中人參皂苷類是人參的主要活性成分[3]。人參皂苷主要分以下三類[4, 5]：（1）、原人參二醇型，有Rb1, Rb2, Rb3, Rc,等；（2）、原人參三醇型，有R1, R2, R3, Rg等；（3）、齊墩果酸型，有Ro, Rh3, Ri等。研究表明，在胃腸道中，人參皂苷代謝成苷元或次苷元更好的表達(dá)藥理活性。

近年來(lái)，難溶性藥物原人參二醇（PPD）由于其抗腫瘤活性[6-8]和抗疲勞[9]，抗抑郁[10]等腦內(nèi)活性近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)，但其溶解性差，生物利用度低限制其腦內(nèi)活性的研究。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%的有較強(qiáng)藥理活性的候選藥物由于水溶性差導(dǎo)致研發(fā)被迫中止[11]?，F(xiàn)今已有很多方法解決難溶藥的溶解度問(wèn)題，如添加增溶劑，形成包合物或絡(luò)合物等，但是這些技術(shù)局限于某些結(jié)構(gòu)的化合物，如環(huán)糊精包合物需要分子大小與其中間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)契合。而把藥物制成納米晶混懸液是一種適合難溶藥制劑開(kāi)發(fā)的新技術(shù)，納米晶具有載藥量為100 %，沒(méi)有納米粒聚合物載體材料[12]，可提高藥物的溶解度，進(jìn)而提高藥物的生物利用度等優(yōu)點(diǎn)。因此，可以通過(guò)制劑化手段改善PPD的生物利用度來(lái)提高其血藥濃度，針對(duì)PPD的理化性質(zhì)，納米晶體混懸液給藥系統(tǒng)可望解決以上問(wèn)題。

作者利用高效液相色譜法測(cè)定納米混懸液體外含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ,該方法重復(fù)性良好，方便快捷。為日后20（S）-原人參二醇納米混懸液制劑的含量測(cè)定、質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試料

高效液相色譜儀（Agilent 1200 Series）由四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管數(shù)組檢測(cè)器組成（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）；Zorbax SB-C18 色譜柱（4.6×250 mm, 5 μm，Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA, USA）；恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，中國(guó)）； Nano-Zetasizer 動(dòng)態(tài)光粒徑測(cè)定儀（Malvern，UK）；EL204-IC 電子天平（瑞 士 Mettler Toledo 公司）；Allegra X-15R 離心機(jī)（Beckman，USA）；冷凍干燥機(jī)（Coolsafe 110，Scanlaf，Denmerk）；

原人參二醇 （純度>98%,成都普菲爾生物技術(shù)有限公司），甲醇，乙腈（Merk，Germany）；維生素E聚乙二醇琥珀酸酯TPGS （Sigma-Aldrich）；丙酮購(gòu)于天津凱通化學(xué)試劑公司；超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原人參二醇納米混懸液的制備

精密稱取5 mg PPD溶解于1 mL丙酮中，在1 000 r/min條件下，注入到10 mL含0.015%（/）TPGS水相中，繼續(xù)高速攪拌5 min，超濾法除有機(jī)溶劑，高速離心25 min，用等體積超純水復(fù)溶，得到樣品PPD納米晶混懸液。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

配置PPD甲醇溶液200 μg/mL, 通過(guò)HPLC 1200 全波長(zhǎng)掃描，確定高效液相色譜法中PPD的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

色譜柱：Zorbax SB-C18（250×4.6 mm, 5μm, Agilent）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流動(dòng)相：待優(yōu)化。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱定5.77 mg PPD樣品，甲醇溶解定容與5 mL 容量瓶中，得到濃度為1154 μg/mL 的PPD儲(chǔ)備液。分別用移液管精密量取儲(chǔ)備液，甲醇對(duì)半稀釋，得到 1 154, 577，288.5，115.4，57.7，23.08μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。按照2.2項(xiàng)下優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣，PPD標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，HPLC峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，考察濃度與峰面積的線性關(guān)系。

圖1 PPD的全波長(zhǎng)掃描圖

2.5 精密度和準(zhǔn)確度考察

分別取線性范圍內(nèi)的23.08, 284.48, 1 154 μg/mL高、中、低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，一天之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，連續(xù)進(jìn)樣3天，HPLC測(cè)定樣品。將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度，并與實(shí)際濃度進(jìn)行比較，從而計(jì)算準(zhǔn)確度，并且，以PPD測(cè)定濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評(píng)價(jià)日內(nèi)與日間精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下任意濃度作為供試品溶液，放置24 h，每隔2 h按照2.2項(xiàng)下優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣3次，計(jì)算平均峰面積。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已制備的PPD納米混懸液1 mL（約含PPD 0.5 mg），分別加入80%，100%，120% 已配制完的PPD對(duì)照品溶液（0.512 4 mg/mL），按照2.2項(xiàng)下優(yōu)化的色譜條件依次進(jìn)樣，平行測(cè)定3次，計(jì)算樣品中含量。

2.8 原人參二醇納米混懸液的凍干與重分散試驗(yàn)

取已制備完的 0.4 mg/mL 的 PPD 納米晶混懸液，加入不同種類與濃度的凍干保護(hù)劑。樣品攪拌加入凍干保護(hù)劑溶解后，放入-80 oC 冰箱中預(yù)凍 12 h 以上， 后移入冷凍干燥機(jī)中凍干48 h以上，確保全部成為凍干粉。將凍干粉溶解于一定量超純水中獲得重分散體系。測(cè)定重分散后的混懸液的粒徑和 PdI，篩選 出具有良好分散性的凍干保護(hù)劑。凍干 PPD 納米晶混懸液候選保護(hù)劑如表1所示。

表1 不同種類凍干保護(hù)劑的濃度

3 結(jié)果與討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

由HPLC1200得到原人參二醇在210~400 nm的全波長(zhǎng)掃描圖，如圖1所示。

原人參二醇甲醇溶液在210 nm處有最大吸收，所以選擇210 nm作為HPLC方法中的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

調(diào)節(jié)乙腈與水的比例，得到的色譜結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著乙腈比例的增加，PPD的保留時(shí)間減小。為縮短分析時(shí)間，流動(dòng)相比例確定為乙腈∶水（/）=90∶10 （/）。

表2 HPLC流動(dòng)相比例優(yōu)化

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將PPD的濃度與對(duì)應(yīng)的HPLC積分所得峰面積進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程為：

=4.813 5-25.593（2=0.999 9）

式中：—積分所得峰面積；

—PPD濃度。

在23.08~1 154 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

3.4 精密度和準(zhǔn)確度的考察

該檢測(cè)方法高、中、低濃度準(zhǔn)確度以及日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度如表3。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間精密度的RSD值均小于3%, 準(zhǔn)確度在96%~103%之間，說(shuō)明所建立的高效液相色譜方法的精密度和準(zhǔn)確度均良好。

圖2 PPD的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 PPD的日間和日內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

結(jié)果表明，24 h內(nèi)測(cè)定的RSD值為1.45%, 說(shuō)明PPD甲醇溶液穩(wěn)定性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

該檢測(cè)方法測(cè)定加樣回收實(shí)驗(yàn)如表4。結(jié)果表明，加樣回收率為100.84%，RSD值＜3%，說(shuō)明該高效液相色譜法的準(zhǔn)確度良好。

表4 PPD的加樣回收率試驗(yàn)

3.7 原人參二醇納米混懸液的凍干與重分散試驗(yàn)

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，凍干保護(hù)劑對(duì)PPD納米混懸液的凍干后重分散的影響不同。當(dāng)加入乳糖和糊精在PPD納米混懸液凍干重分散時(shí)，有明顯沉降發(fā)生，無(wú)法復(fù)溶。當(dāng)使用不同濃度的葡糖、D-海藻糖和0.5% 羥丙基-β-環(huán)糊精時(shí)，雖然可以使PPD納米混懸液重新分散，但是粒徑較大，且不均一。當(dāng)使用1.5%和5%濃度的羥丙基-β-環(huán)糊精時(shí)，復(fù)溶后，粒徑?jīng)]有明顯變化，且PdI<0.3，體系較均一。在加入5%的羥丙基-β-環(huán)糊精時(shí)，由于濃度較高，在水中攪拌溶解時(shí)間較長(zhǎng)。根據(jù)上述結(jié)果，因此最后確定以1.5%的羥丙基-β-環(huán)糊精作為PPD納米混懸液的凍干保護(hù)劑。

4 討論

本文曾以210 nm為波長(zhǎng)，不同比例甲醇∶水作為流動(dòng)相優(yōu)化色譜條件，甲醇∶水=70∶30時(shí)，保留時(shí)間為29 min；甲醇∶水=80∶20時(shí)，保留時(shí)間為25 min；甲醇∶水=90∶10時(shí)，保留時(shí)間為18 min。嘗試用乙腈∶水作為流動(dòng)相梯度洗脫，但是由于其基線不穩(wěn)，漂移且出現(xiàn)平峰、拖尾等問(wèn)題，而最終選擇以乙腈∶水=90∶10作為流動(dòng)相，流速1 mL/min，效果較好。

［1］ Liu, C.X. and P.G. Xiao, Recent advances on ginseng research in China[J]., 1992，36（1）: 27-38．

［2］張均田. 人參研究的最新進(jìn)展[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2009, 19（03）: 185-191．

［3］Kitts, D. and C. Hu, Efficacy and safety of ginseng[J]., 2000, 3（4A）: 473-85．

［4］Choi, K.T., Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng C A Meyer[J]., 2008, 29（9）: 1109-18.

［5］張靜靜, 劉桂芹, 王慶鵬，李蘭杰. 植物三七中皂苷類化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J]. 聊城大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2018, 31（02）: 43-52+59．

［6］Liu, G.Y., et al., 20S-protopanaxadiol-induced programmed cell death in glioma cells through caspase-dependent and -independent pathways[J]., 2007, 70（2）: 259-64.

［7］Zhang, Z., et al., TRAIL pathway is associated with inhibition of colon cancer by protopanaxadiol[J]., 2015, 127 （1）: 83-91．

［8］Zhu, G.Y., et al., 20（S）-Protopanaxadiol, a metabolite of ginsenosides, induced cell apoptosis through endoplasmic reticulum stress in human hepatocarcinoma HepG2 cells[J]., 2011, 668（1-2）: 88-98.

［9］Oh, H.A., et al., Anti-fatigue Effects of 20（S）-Protopanaxadiol and 20（S）-Protopanaxatriol in Mice[J]., 2015, 38（9）: 1415-9.

［10］Xu, H., et al., Protective effect of Panax quinquefolium 20（S）-protopanaxadiol saponins, isolated from Pana quinquefolium, on permanent focal cerebral ischemic injury in rats[J]., 2014, 7（1）: 165-170．

［11］Cooper, E.R., Nanoparticles: a personal experience for formulating poorly water soluble drugs[J]., 2010,141: 300-302.

［12］Junghanns, J.-U.A., M Li, S.L., Sun, E., Tan, X.B., Sechnology, drug delivery and clinical applications[J]., 3, 295.

Study on Determination of the In Vitro Content of Protopanaxadiol Nanosuspension and Its Lyophilized Protective Agent

,

（Liaoning Vocational College of Medicine, Liaoning Shenyang 113001, China）

Using 20 (S) -protopanaxadiol as research object, 20 (S) -protopanaxadiol nanosuspension was prepared by anti-solvent precipitation.An in vitro analytical method of protopanaxadiol by HPLC was established, and the liquid phase conditions were optimized as follows: the mobile phase acetonitrile and water(acetonitrile∶water=90∶10),the wavelength 210 nm.The standard curve, precision and accuracy were investigated. The results showed that the protopanaxadiol had good linearity in the range of 23.08~1 154 μg/mL,intra-day and inter-day precision RSD values were less than 3%,the accuracy was between 96%~103%, and the recovery rate was 100.84%.This method met the requirements for the in vitro determination of protopanaxadiol.At last,its lyophilized protective agents were screened, and 1.5% hydroxypropyl-β-cyclodextrin was finally determined as suitable lyophilized protective agent.

protopanaxadiol; content determination; lyophilized protective agent

2019-11-18

陳晨（1990-），女，助教，碩士，遼寧省沈陽(yáng)市人，2016年畢業(yè)于澳門大學(xué)中藥學(xué)專業(yè)，研究方向：藥物分析。

孫倩（1985-），女，講師，碩士，研究方向：藥物分析。

O 657

A

1004-0935（2020）02-0140-04