龍勝文，尹梓豪，許斐鈺，丁小鳳

(湖南師范大學生命科學學院， 淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室， 長沙 410081)

乳腺癌是世界上最常見的癌癥之一[1]。據(jù)估計，2014年美國有40 430名女性患者死于乳腺癌[2]。盡管在乳腺癌治療方面取得了一定的突破，但目前估計，轉移性乳腺癌在5年內的生存率低于25%，10年內的生存率為5%～10%[3]。手術和化療是治療乳腺癌的主要兩種方式,而腫瘤細胞的耐藥是導致化療失敗的主要原因。因此，進一步探索乳腺癌治療耐藥的新機制對于了解乳腺癌的發(fā)展和設計治療靶標至關重要。

在轉錄過程中存在不同的修飾而6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物中mRNAs[4],microRNAs[5],longnon-coding RNAs[6]最豐富的內部化學修飾。RNA的m6A修飾主要發(fā)生在3′UTR[7,8]和5′UTR[9]，與RNA的轉錄、加工、翻譯以及代謝過程有關。m6A的修飾是一個動態(tài)的調控過程，主要涉及三類調控蛋白，包括甲基轉移酶(METLL3,METTL14,WTAP,KIAA1429)[10-15]，去甲基化酶(FTO,ALKBH5)[16-18]和讀取蛋白(YTHDF1/2/3,YTHDC1/2,IGF2BP11/2/3,eIF3)[9,19-25]。最近研究表明m6A相關蛋白參與了不同類型癌癥的發(fā)生、發(fā)展，如膠質母細胞瘤、急性髓性白血病、肝細胞癌、直腸癌、腎細胞癌和乳腺癌[26-31]以及癌癥治療耐藥發(fā)展的過程，如胰腺癌、白血病、宮頸鱗狀細胞癌和膠質母細胞瘤[29,32-34]。然而，作為m6A甲基轉移酶組合的關鍵組分，Wilms腫瘤1相關蛋白(Wilms’ tumor 1-associating protein,WTAP)在乳腺癌治療耐藥中的功能作用暫無報道，本次研究在MCF-7細胞中過表達WTAP，耐藥細胞系MCF-7/ADR細胞中敲低WTAP的表達，觀察其對細胞遷移的影響并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞系MCF-7購自中科院上海細胞庫。MCF-7/ADR細胞系購自上海酶研生物科技有限公司。質粒構建的pCMV-Myc載體購自Clone-tech公司。siRNA購自蘇州吉瑪基因公司。RNA Trizol提取試劑和SYBR Green實時定量PCR試劑盒購自Takara公司。用于內參檢測的GAPDH抗體購自Sigma公司。Myc-Tag抗體購自武漢三鷹公司。Vimentin、E-cadherin、N-cadherin和Snail抗體購自ABclonal公司。WTAP抗體購自Abcam公司。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度恒溫箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于試驗。MCF-7/ADR細胞培養(yǎng)于500 ng/mL Adriamycin(ADR)中，在正式試驗前撤藥培養(yǎng)2周。

1.2.2 MTT法檢測阿霉素對MCF-7和MCF-7/ADR細胞活力的影響

取對數(shù)生長期細胞，按每孔6×103個細胞接種至96孔板，每孔加100 μL的細胞懸液。培養(yǎng)24 h后，每孔補加不同濃度的阿霉素使其終濃度分別為0、10、20、40、80、160、320、640 μmol/L。同時設空白對照(不加細胞，只加培養(yǎng)基)，每組設5個平行孔。藥物處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL的MTT液100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去MTT液，每孔加入120 μL的DMSO并避光輕搖15 min。酶標儀測定490 nm波長處吸光度值。

1.2.3 熒光定量PCR

首先用Trizol法提取RNA，然后按照逆轉錄試劑盒操作說明將獲得的RNA反轉錄成cDNA。按照SYBR GreenqPCR試劑盒步驟檢測ythdf2、mettl3、mettl14、wtap和fto的表達，所用的引物見表1。

表1 引物名稱及其序列Tab.1 The name and sequences of primers

1.2.4pCMV-Myc-wtap重組載體的構建

以從MCF-7細胞中抽提的RNA反轉錄成的cDNA作為模板，以wtapF:5′-GAATCATGACCAACGAA GAACCTCTTC-3′和wtapR:5′-GGTACCTGTACAGGGT TCAGTTTTGTAA-3′(在5′端引入了EcoRI的酶切位點，在3′端引入了KpnI的酶切位點，下劃線序列為酶切位點)為引物，應用KOD FX DNA聚合酶(Toyobo)進行PCR擴增，擴增條件：94 ℃變性5 min，然后98 ℃15 s，64 ℃20 s，68 ℃60 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。獲得wtap完整的編碼序列。連入真核生物表達載體pCMV-Myc中，EcoRI和KpnI雙酶切驗證后，測序確認序列的正確性。

1.2.5 細胞轉染

轉染前一天取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，在過表達WTAP的孔板中每孔接種4×105個細胞，用于干擾WTAP表達的孔板中每孔接種2×105個細胞。培養(yǎng)至24 h，按LipofectamineTM2000脂質體轉染說明書操作，將脂質體與pCMV-Myc、pCMV-Myc-wtap質?；騈C siRNA、wtapsiRNA分別經(jīng)無血清DMEM培養(yǎng)基均勻混合后，分別加至細胞中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.6 細胞遷移試驗

按1.2.4細胞轉染步驟將干擾和過表達WTAP的細胞分別培養(yǎng)24、48 h。消化細胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，調整細胞濃度為2×105個/mL。在下室加入700 μL含20%血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μL的細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將MCF-7細胞培養(yǎng)36 h，MCF-7/ADR細胞培養(yǎng)24 h，取出小室，吸干上室液體，用甲醇室溫固定30 min。移除固定液，用結晶紫室溫染色30 min，用清水浸泡數(shù)次，取出小室，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞。拍照，統(tǒng)計。

1.2.7 Western blot檢測WTAP、Snail、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

按1.2.4細胞轉染步驟將干擾和過表達WTAP的細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h。用胰酶消化收集細胞，加RIPA細胞裂解液，于冰上放置30 min，抽提細胞全蛋白，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束，將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入抗WTAP抗體、Snail抗體、Vimentin抗體、E-cadherin抗體和N-cadherin抗體。4 ℃孵育過夜。次日，加HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，加ECL化學發(fā)光底物，在全自動凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。

1.3 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 WTAP在MCF-7/ADR細胞中高表達

我們首先用MTT法檢測阿霉素對MCF-7和MCF-7/ADR細胞活力的抑制。試驗發(fā)現(xiàn)阿霉素對MCF-7和MCF-7/ADR的細胞活力都有不同程度的抑制作用，且對MCF-7細胞活力的抑制作用大于對MCF-7/ADR細胞的抑制作用，如圖1a所示(P<0.01)。然后用熒光定量試驗檢測MCF-7和MCF-7/ADR細胞中與m6A相關基因的mRNA表達水平，與MCF-7細胞相比，RNA甲基化酶wtap和去甲基化酶fto的mRNA在MCF-7/ADR細胞中高表達，而RNA甲基化酶mettl3、mettl14和閱讀基因ythdf2低表達，如圖1b所示(P<0.05)。我們選取RNA甲基化酶wtap進行后續(xù)的研究，用western-blot試驗進一步檢測到MCF-7/ADR細胞中WTAP蛋白高表達，與mRNA表達水平一致，如圖1c所示。這說明WTAP在MCF-7/ADR耐藥細胞中高表達，提示wtap可能與乳腺癌細胞的耐藥有關。

圖1 MCF-7和MCF-7/ADR細胞中m6A相關基因的mRNA和WTAP蛋白表達分析Fig.1 Expression analysis of mRNA level of m6A related genes and WTAP protein in MCF-7 and MCF-7/ADR cells(a)MTT法檢測阿霉素對MCF-7和MCF-7/ADR細胞活力的影響；(b)qPCR試驗檢測m6A相關基因在MCF-7和MCF-7/ADR細胞中的表達；(c)Western-blot試驗檢測WTAP在MCF-7和MCF-7/ADR細胞中的表達，星號表示組間差異有統(tǒng)計學意義(*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)(a)MTT assay detected the effect of adriamycin on the activity of MCF-7 and MCF-7/ADR cells;(b)qPCR assay detected the mRNA expression of m6A related genes in MCF-7 and MCF-7/ADR cells;(c)Western-blot assay detected the expression of WTAP in MCF-7 and MCF-7/ADR cells, the asterisks indicate a statistically significant difference(*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)

2.2 過表達WTAP對MCF-7細胞的遷移沒有影響

為了進一步驗證wtap在乳腺癌細胞MCF-7和MCF-7/ADR中的作用，我們構建了wtap過表達質粒。首先用PCR擴增wtap基因的全長編碼序列，獲得1 191 bp的片段，如圖2a所示，將其插入pCMV-Myc真核表達載體中，轉化宿主菌DH5α，提取質粒。將提取的質粒經(jīng)EcoRI和KpnI雙酶切驗證，得到相應的wtap片段，如圖2b所示。將質粒測序，測序結果顯示pCMV-Myc-wtap構建成功。擴增正確的pCMV-Myc-wtap質粒，進行大量制備，以轉染MCF-7細胞，用western blot鑒定pCMV-Myc-wtap重組質粒，如圖2c所示，結果說明pCMV-Myc-wtap重組質粒已成功表達WTAP蛋白。我們在MCF-7細胞中過表達WTAP，用細胞遷移試驗檢測WTAP對MCF-7細胞遷移的影響。在過表達WTAP后，MCF-7細胞的遷移相比對照組沒有發(fā)生顯著性的變化，結果如圖2d所示，2e為2d圖的細胞遷移情況做量化統(tǒng)計。這些結果表明WTAP對MCF-7乳腺癌細胞的遷移沒有影響。

圖2 pCMV-Myc-wtap重組質粒的酶切鑒定及對MCF-7細胞遷移的影響Fig.2 Identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-wtap by the digestion and the effect of WTAP on the migration of MCF-7 cells(a)wtap的PCR片段；(b)pCMV-Myc-wtap重組質粒EcoRI和KpnI的雙酶切；(c)Western-Blot檢測外源WTAP的表達；(d,e)遷移試驗檢測過表達WTAP對MCF-7細胞遷移的影響(a)PCR fragments of wtap;(b)Recombinant plasmid pCMV-Myc-wtap by EcoRI and KpnI digestion;(c)Western-Blot detected the expression of exogenous WTAP;(d,e)Transwell assay detected the effect of WTAP overexpression on cell migration of MCF-7cells

2.3 敲低WTAP的表達會抑制MCF-7/ADR細胞的遷移

我們用WTAPsiRNA干擾片段轉染MCF-7/ADR細胞，用western blot檢測WTAP siRNA干擾片段的有效性，結果如圖3a所示，表明WTAP siRNA的干擾片段是有效的。然后進一步用細胞遷移試驗檢測WTAP敲低對MCF-7/ADR細胞遷移的影響。相比較于對照組，敲低WTAP的表達會抑制MCF-7/ADR細胞的遷移，結果如圖3b所示(P<0.001)。圖3c對圖3b細胞的遷移情況做量化統(tǒng)計。該結果表明敲低WTAP的表達會抑制MCF-7/ADR細胞的遷移。

圖3 敲低WTAP對MCF-7/ADR細胞遷移的影響Fig.3 Effect of WTAP knockdown on migration of MCF-7/ADR cells(a)Western-blot檢測MCF-7/ADR細胞中WTAP siRNA轉染效果；(b,c)遷移試驗檢測敲低WTAP對MCF-7/ADR細胞遷移的影響,星號表示組間差異有統(tǒng)計學意義(*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)(a)MCF-7/ADR cells transfected with WTAP siRNA was detected by western-blot；(b,c)Transwell assay detected the effect of WTAP knockdown on the cell migration of MCF-7/ADR cells, the asterisks indicate a statistically significant difference(*P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001)

2.4 敲低WTAP的表達會抑制上皮間質轉化

我們用pCMV-Myc-wtap轉染MCF-7細胞，WTAP siRNA干擾片段轉染MCF-7/ADR細胞，分別培養(yǎng)至24 h和48 h，收集蛋白，western-blot檢測WTAP、Snail、Vimentin和E-cadherin、N-cadherin蛋白水平的變化，GAPDH做內參。當在MCF-7細胞中增加WTAP的表達時，和對照組相比上皮分子標志物E-cadherin，間質細胞分子標記物N-cadherin、Vimentin和Snail的表達沒有差異性的變化，結果如圖4a所示。而在MCF-7/ADR細胞中敲低WTAP的表達時，和對照組相比上皮分子標志物E-cadherin的表達上調，間質細胞分子標記物N-cadherin、Vimentin和Snail的表達則下調，結果如圖4b所示。這些結果表明敲低WTAP的表達能夠抑制上皮間質轉化。

圖4 Western-blot檢測敲低和過表達WTAP對E-cadherin、Snail、Vimentin和N-cadherin的影響Fig.4 Effects of WTAP knockdown and overexpression on E-cadherin,Snail,Vimentin and N-cadherin detected by western-blot(a)Western blot檢測pCMV-Myc-wtap轉染MCF-7細胞對E-cadherin,Snail,Vimentin和N-cadherin蛋白表達的影響;(b)Western- blot檢測WTAP siRNA轉染MCF-7/ADR細胞對E-cadherin、Snail、Vimentin和N-cadherin蛋白表達的影響(a)Westernblot detected the effect of WTAP overexpression on E-cadherin、Snail、Vimentin and N-cadherin of MCF-7 cells;(b)Western- blot detect the effects of WTAP knockdown on E-cadherin、Snail、Vimentin and N-cadherin of MCF-7/ADR cells

3 討論

WTAP由Little NA等首次發(fā)現(xiàn)，因與Wilms腫瘤抑制基因wt1特異性相互作用從而得名[35]。研究證明，wtap除了參與mRNA穩(wěn)定[36]、眼睛發(fā)育[37]、m6A甲基化[38]、細胞增殖、凋亡及細胞周期調控[39]等一些基本的生理過程。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要的作用，如WTAP在膠質瘤細胞以及膠質瘤組織樣本中高表達，通過EGF-EGFR-AKT信號軸參與膠質瘤細胞的增殖、遷移及侵襲[40-42]。在急性髓性白血病細胞異常增殖中wtap也起重要作用[26]。Zhang等[43]發(fā)現(xiàn)，在直腸癌細胞中CA4通過與WTAP發(fā)生相互作用，使WTAP多聚泛素化使其表降解進而減少WTAP/WT1復合物，增加游離的WT1，促進WT1與TBTL1發(fā)生相互作用進而降解β-catenin從而降低Wnt信號通路抑制結腸直腸癌細胞的EMT和G1/S期。對于膽管癌，過表達或者干擾WTAP會增加或減少膽管癌細胞的遷移與侵襲[44]。一系列研究證明了wtap參與了腫瘤的增殖、遷移與侵襲，但對于雌激素和孕激素受體陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及治療耐藥有何意義，目前尚暫無報道。

為了探索wtap在雌激素和孕激素受體陽性乳腺癌耐藥中的作用，本研究選取雌激素和孕激素受體陽性乳腺癌MCF-7和耐阿霉素藥物的乳腺癌MCF-7/ADR細胞系進行研究。WTAP在MCF-7/ADR細胞中高表達，表明WTAP可能參與乳腺癌MCF-7細胞的耐藥過程。Jeon[45]和W[46]等發(fā)現(xiàn)耐藥的腫瘤細胞通常會伴隨著許多其他細胞生物活性方面的變化，包括腫瘤細胞遷移與侵襲性的增加。為了更深入研究WTAP參與乳腺癌MCF-7細胞的耐藥的作用，我們在MCF-7/ADR細胞中轉入WTAP siRNA，通過遷移試驗發(fā)現(xiàn)敲低WTAP表達后MCF-7/ADR細胞的遷移能力也隨之降低，而在MCF-7細胞中過表達WTAP則對MCF-7細胞遷移沒有影響。總之，本試驗表明敲低WTAP的表達可以抑制MCF-7/ADR細胞的遷移能力。

有研究證明，化療藥物常導致上皮間質轉化過程的增加[47,48]。上皮間質轉化是指上皮細胞失去極性而重組細胞骨架，轉變具有遷移能力的間質表型的過程，上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一個多步驟的過程，伴隨細胞形態(tài)學的變化和多種上皮和間充質基因的轉錄和水平改變有關。冀峰等[49]發(fā)現(xiàn)耐阿霉素藥物的乳腺癌MCF-7的EMT能力比MCF-7腫瘤細胞要更強。本研究顯示，wtap基因表達受到抑制后，MCF-7/ADR細胞中的EMT過程受到抑制，表現(xiàn)為上皮分子標志物E-cadherin表達上調，間質細胞分子標記物N-cadherin、Vimentin和Snail表達下調。這表明抑制wtap基因的表達，減弱了MCF-7/ADR細胞的遷移能力，其中的機制可能和EMT過程受到抑制有關。EMT在多種腫瘤侵襲和轉移過程中扮演著重要的角色[50-52]。盡管EMT所涉及的分子機制取得了實質性的進展，但是EMT作為治療耐藥的潛在生物標志物和潛在藥物靶點的臨床意義值得進一步研究。WTAP作為一個癌基因，參與了不同腫瘤的增殖、遷移與侵襲[42-44]。本研究也表明WTAP通過影響EMT的發(fā)生參與乳腺癌MCF-7/ADR細胞的耐藥，因此WTAP可以作為臨床治療耐藥的潛在生物標志物和潛在的藥物靶點之一。