馬佳康，任凱凱，藺小艷，侯明宇，周 博，馬 軍

0 引 言

胰腺癌是最致命和最具侵襲性的癌癥之一，5年生存率極低[1-2]。盡管外科治療手段越來越多，但大約70%的患者在術(shù)后6～12個月內(nèi)仍會出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)[3]。因此，我們需要進(jìn)一步探索其發(fā)病機(jī)制，找到更有效的診斷標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs，lncRNA)為超過200個核苷酸序列組成的非編碼RNA[4]。在多種腫瘤中都存在著IncRNA的異常表達(dá)，其功能與癌癥生物學(xué)的許多方面有關(guān)，如分化、凋亡、印記、細(xì)胞周期[5-6]。近來發(fā)現(xiàn)lncRNA在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮越來越重要的作用[7]。本研究旨在研究胰腺癌中影響免疫浸潤相關(guān)的lncRNA-mRNA調(diào)控通路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和表達(dá)矩陣構(gòu)建從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胰腺癌轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)以及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，構(gòu)建完整的基因表達(dá)矩陣和臨床信息矩陣。從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE86436探針芯片表達(dá)矩陣信息，對GSE98269數(shù)據(jù)集利用平臺文件GPL13825[Arraystar Human LncRNA microarray V2.0 (Agilent-033010 Feature Number version)]，根據(jù)探針序列利用 BLAST軟件進(jìn)行重注釋，進(jìn)而構(gòu)建完整的基因表達(dá)矩陣。

1.2差異分析以及生存分析對構(gòu)建好TCGA胰腺癌的lncRNA表達(dá)矩陣?yán)肦軟件edgeR包，以|log2FC| >1,P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行差異分析，對GSE86436利用R軟件limma包按照|log2FC| >1,P<0.05進(jìn)行差異分析。對兩者獲得差異基因取交集后，結(jié)合TCGA的生存信息利用R語言survival包以及survminer包中的surv_cutpoint函數(shù)選擇最佳的cutoff值進(jìn)行生存分析，篩選出共同差異且和生存相關(guān)的lncRNA。

1.3lncRNA與臨床信息關(guān)聯(lián)性分析將ADAMTS9-AS1表達(dá)量與TCGA胰腺癌樣本臨床信息(病理分級、stage分期、T分期、N分期)進(jìn)行相關(guān)性分析，鑒定出ADAMTS9-AS1表達(dá)所影響的臨床特征，由于M分期大部分為MX分期(無法確定有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)未行進(jìn)一步研究。

1.4lncRNA相關(guān)靶基因篩選將TCGA胰腺癌差異mRNA與各樣本病理分級信息相關(guān)聯(lián)，鑒定出所有和病理分級相關(guān)的差異mRNA，將此部分mRNA和ADAMTS9-AS1進(jìn)行相關(guān)性分析，鑒定出|r|>0.4以及P<0.05的mRNA。利用IMMPORT(https://www.immport.org/shared/home)數(shù)據(jù)庫下載免疫相關(guān)基因列表，篩選出上述靶基因中免疫相關(guān)的基因。

1.5SEMA3G和 ADAMTS9-AS1免疫浸潤相關(guān)分析利用 TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)下載TCGA樣本中免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4_T細(xì)胞、CD8_T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)浸潤水平矩陣，將SEMA3G和ADAMTS9-AS1表達(dá)信息與該矩陣行相關(guān)性分析，分析 SEMA3G和ADAMTS9-AS1對胰腺癌中免疫細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性。

1.6ADAMTS9-AS1相關(guān)GO以及KEGG富集分析將ADAMTS9-AS1相關(guān)性較高的差異基因(靶基因)利用clusterProfiler包進(jìn)行GO富集以及KEGG富集分析，根據(jù)P<0.05篩選出相關(guān)的條目和 KEGG通路。

1.7基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)分析利用GSEA工具v3.0(http://www.broadistitute.org/gsea)，選擇基因集c2.cp.kegg.v6.2.symbols進(jìn)行單基因GSEA。通過排列檢驗(yàn)(1000次排列檢驗(yàn))以FDR<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選富集結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADAMTS9-AS1的篩選ADAMTS9-AS1高表達(dá)的胰腺癌患者較低表達(dá)患者有更高的生存率(P=0.010)，見圖1。ADAMTS9-AS1在TCGA的差異情況為log2FC=-1.70，P=0.017；GSE86436為log2FC=-1.78，P=0.006。

2.2GO以及KEGG富集分析篩選出ADAMTS9-AS1相關(guān)性較強(qiáng)的差異mRNA，進(jìn)行GO以及KEGG富集分析，GO富集結(jié)果共篩選到356條目，結(jié)果與免疫相關(guān)，如白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、腫瘤壞死因子超家族細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控、白細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控、腫瘤壞死因子超家族細(xì)胞因子產(chǎn)生、免疫系統(tǒng)過程負(fù)性調(diào)節(jié)、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子的反應(yīng)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激的細(xì)胞反應(yīng)、白細(xì)胞遷移以吞噬作用的調(diào)節(jié)等。KEGG結(jié)果共篩選到9個通路，分別為金黃色葡萄球菌感染、細(xì)胞周期、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、破骨細(xì)胞分化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、百日咳以及人T細(xì)胞白血病病毒1感染。見圖2。

2.3ADAMTS9-AS1免疫浸潤分析通過將ADAMTS9-AS1的表達(dá)數(shù)據(jù)和TIMER數(shù)據(jù)庫中TCGA免疫浸潤數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)ADAMTS9-AS1的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)。其中，與B細(xì)胞浸潤(r=0.311)、CD4_T細(xì)胞浸潤(r=0.303)、CD8_T細(xì)胞浸潤(r=0.455)、中性粒細(xì)胞浸潤(r=0.391)、巨噬細(xì)胞浸潤(r=0.477)、樹突狀細(xì)胞浸潤(r=0.366)呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖3。

圖 1 ADAMTS9-AS1生存曲線

Figure1SurvivalcurveofADAMTS9-AS1

a:GO分析； b:KEGG分析

圖 2 ADAMTS9-AS1相關(guān)的GO以及KEGG圖

Figure2GOandKEGGdiagramsrelatedtoADAMTS9-AS1

圖 3 ADAMTS9-AS1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤程度相關(guān)性分析

Figure3AnalysisofthecorrelationbetweenADAMTS9-AS1expressionandthelevelofimmunecellinfiltration

2.4ADAMTS9-AS1與病理分級密切相關(guān)ADAMTS9-AS1的表達(dá)量在病理分級(G1+G2vsG3+G4)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.012)，在stage分期(I、II、III)、T分期(T1+T2vsT3+T4)、N分期(N0vsN1)中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5篩選得到免疫相關(guān)基因SEMA3G為ADAMTS9-AS1的靶基因?qū)⒉町恗RNA與臨床病理分級進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出與56個相關(guān)差異基因，與ADAMTS9-AS1進(jìn)行共表達(dá)分析，篩選得到18個基因與ADAMTS9-AS1明顯相關(guān)。對照IMMPORT數(shù)據(jù)庫中2498個腫瘤免疫相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)SEMA3G為免疫相關(guān)基因并且與ADAMTS9-AS1相關(guān)性最高(r=0.657，P<0.05)。

2.6SEMA3G免疫浸潤分析對SEMA3G進(jìn)行免疫浸潤分析后發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，其中，與B細(xì)胞浸潤(r=0.309)、CD4_T細(xì)胞浸潤(r=0.431)、CD8_T細(xì)胞浸潤(r=0.270)、中性粒細(xì)胞浸潤(r=0.312)、巨噬細(xì)胞浸潤(r=0.374)、樹突狀細(xì)胞浸潤(r=0.217)呈正相關(guān)(P<0.05)。

2.7ADAMTS9-AS1的GSEA分析通過對ADAMTS9-AS1進(jìn)行單基因GSEA富集分析，結(jié)果顯示 ADAMTS9-AS1與檸檬酸鹽循環(huán)、脂肪酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、溶酶體、過氧化物酶體、丙酸鹽代謝、蛋白酶體、丙酮酸鹽代謝、核糖體、纈氨酸-亮氨酸和異亮氨酸降解通路相關(guān)。

3 討 論

胰腺癌作為侵襲性最強(qiáng)的腫瘤之一，大部分患者在發(fā)現(xiàn)時已是晚期，不能行根治性手術(shù)，患者生存率極低[8]。近年來，隨著檢查點(diǎn)抑制劑免疫治療的突破，腫瘤免疫治療已從輔助治療轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N重要的治療方式，因此全面了解癌癥患者的免疫浸潤情況，對個體選擇正確的免疫治療策略尤為重要[9]。

本研究通過對TCGA以及GEO數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，篩選到與預(yù)后相關(guān)的差異lncRNA ADAMTS9-AS1。為了進(jìn)一步了解該lncRNA的功能，本研究進(jìn)行了GO及KEGG富集分析，富集結(jié)果顯示該基因與免疫明顯相關(guān)，并通過TIMER數(shù)據(jù)庫[10]驗(yàn)證了該lncRNA與胰腺癌中B細(xì)胞、CD4_T細(xì)胞、CD8_T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤呈明顯正相關(guān)，與CD8_T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的相關(guān)性更為顯著。臨床相關(guān)性分析顯示該lncRNA與腫瘤分級呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，由此可見胰腺癌中該lncRNA表達(dá)越高，腫瘤中免疫浸潤越多，腫瘤分級越低，患者預(yù)后越好，與KA等在乳腺癌中的研究相一致[11]。為鑒定出lncRNA的靶基因，本研究利用IMMPOT數(shù)據(jù)庫[12]篩選出與腫瘤分級以及免疫明顯相關(guān)的差異基因SEMA3G[13]，且該基因與ADAMTS9-AS1有明顯的正向相關(guān)性。進(jìn)一步通過TIMER數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了SEMA3G與胰腺癌內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤水平同樣呈正相關(guān)關(guān)系，因此預(yù)測ADAMTS9-AS1-SEMA3G通路在免疫細(xì)胞調(diào)控中起著重要作用。除此之外，通過GSEA發(fā)現(xiàn)了ADAMTS9-AS1也可能參與腫瘤相關(guān)代謝過程，但有待進(jìn)一步研究。

既往研究表明ADAMTS9-AS1在膀胱癌中差異表達(dá)且通過調(diào)控下游的miRNA影響病人的預(yù)后[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS9-AS1在結(jié)腸癌中下調(diào)表達(dá)并且同樣影響患者的總生存率，并通過RT-qPCR再次驗(yàn)證了其在癌和癌旁中的差異情況。有研究證實(shí)過表達(dá)SEMA3G后人胰腺癌細(xì)胞系的增殖、侵襲和遷移能力降低，與本研究中SEMA3G在胰腺癌的負(fù)調(diào)控作用相一致[16]。Tang等[17]發(fā)現(xiàn)SEMA3G在類風(fēng)濕的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，雖然該研究未涉及腫瘤，但體現(xiàn)出該基因重要的免疫調(diào)節(jié)作用。ADAMTS9-AS1在多種腫瘤中起重要作用，SEMA3G在胰腺癌中也起到抑癌基因的重要作用，但目前還沒有關(guān)于兩者在胰腺癌腫瘤免疫方面的相關(guān)研究[18-19]。

本研究檢測到ADAMTS9-AS1和SEMA3G在胰腺癌中下調(diào)，預(yù)測該通路與B細(xì)胞、CD4_T細(xì)胞、CD8_T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤水平增加有關(guān)，初步探討了其與胰腺癌腫瘤免疫浸潤以及胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，為其在腫瘤免疫學(xué)中的潛在作用及其作為腫瘤生物標(biāo)志物提供了依據(jù)。