玉蘇甫卡迪爾·麥麥提尼加提，艾麥提·牙森，張瑞青，吐爾干艾力·阿吉，邵英梅，溫 浩

0 引 言

泡狀棘球蚴病是由泡狀棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis，E.m)寄生于人體而引起的一種腫瘤樣生長(zhǎng)特性的人畜共患病[1]。肝作為泡球蚴感染的主要靶器官，在整個(gè)感染過程中受損最大。泡球蚴感染宿主后，能夠使肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死及鈣化等損傷[2]，其中典型的病理特征是肝纖維化[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transfer growth factor-β, TGF-β)是一組具有多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)的許多病理生理過程起重要調(diào)節(jié)作用。目前發(fā)現(xiàn) TGF-β至少有5種異構(gòu)體，其中TGF-β1是活化肝星狀細(xì)胞 (hepatic stellate cells, HSCs)作用最強(qiáng)的因子，目前被認(rèn)為重要的肝纖維化始動(dòng)因子之一[4]。肌成纖維細(xì)胞是肝纖維化過程中的主要細(xì)胞類型，然而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (a-smooth muscle actin, α-SMA)是成纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐富的分泌性蛋白[5]。近幾年來，關(guān)于TGF-β1和α-SMA在感染性疾病所致肝纖維化過程中的作用成了眾多課題組研究的熱點(diǎn)。

本研究經(jīng)門靜脈注射原頭節(jié)混懸液，參考文獻(xiàn)[6]方法建立泡狀棘球蚴感染小鼠模型，觀察不同時(shí)間點(diǎn)泡狀棘球蚴感染小鼠肝病理學(xué)改變及檢測(cè)TGF-β1和α-SMA在感染小鼠肝組織的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，探討TGF-β1在泡球蚴感染所致肝纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人工腹腔感染多房棘球蚴的長(zhǎng)爪沙鼠,雄性，18周齡，1只，購(gòu)自于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，8～10周齡, 45只，體重(18±2)g ，購(gòu)自于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK (新)2018-0003。所有小鼠飼養(yǎng)于溫度：19～21℃，濕度：50%～60%，12 h明暗交替環(huán)境下飼養(yǎng)。自由飲食、飲水。

1.1.2主要儀器和試劑儀器：組織自動(dòng)包埋機(jī)(LeicaEG1160)及石蠟組織切片機(jī)(Leica2245)均來自德國(guó)Leica公司。光學(xué)顯微鏡(CX3IRBSF)為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，圖像采集系統(tǒng) (Ex-wave-HAD)為日本SONY公司產(chǎn)品。試劑： 兔抗小鼠TGF-β1單克隆抗體、兔抗小鼠α-SMA多克隆抗體、HRP標(biāo)記親和純化的山羊抗兔IgG(H+L)二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；抗抗體稀釋液、山羊血清封閉液、DAB顯色液、PBS、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、4%多聚甲醛、中性樹膠均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；天狼星紅染色試劑盒購(gòu)自南京森貝咖生物科技有限公司；糖原PAS染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 泡球蚴原頭節(jié)混懸液的制備將長(zhǎng)爪沙鼠處死，在無菌環(huán)境下開腹，直視下取出腹腔中的棘球蚴組織(選取較為透亮，成簇的泡球蚴組織)，用PBS緩沖液沖洗3次后，將組織剪碎，研磨，過篩，再用PBS緩沖液反復(fù)漂洗至混懸液呈乳白色，配成濃度為20%的原頭節(jié)混懸液，用于小鼠接種。

1.2.2泡狀棘球蚴感染小鼠模型的建立45只C57BL/6小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(30只)和對(duì)照組(15只)。2組小鼠分別用4%水合氯醛溶液腹腔注射0.1 mL/10 g，待完全麻醉后乙醇消毒上腹部皮膚，打開腹腔，直視下找出小鼠門靜脈，模型組注入配好的原頭節(jié)混懸液(按4000 個(gè)/只計(jì)算)，對(duì)照組注入等量的等滲鹽水，局部止血3 min，用細(xì)線間斷縫合關(guān)腹。小型電熱毯傳熱復(fù)蘇，飼養(yǎng)于清潔屏障(SPF級(jí))環(huán)境。

1.2.3標(biāo)本采取分別于造模后1、2、4、8、12周處死模型組6只，對(duì)照組3只小鼠，采取肝組織；將上述組織標(biāo)本置于4%的多聚甲醛溶液固定24～48 h后，常規(guī)脫水，經(jīng)石蠟包埋后，切厚約4 μm薄片備用。

1.2.4HE染色將薄片放入60 ℃烤箱烤烘40 min后常規(guī)脫蠟，放入蒸餾水浸洗2次×3 min，隨后浸泡蘇木素溶液1.5 min，立即蒸餾水沖洗至泛色，用鹽酸乙醇分化2 s，再放入蒸餾沖洗水40 s后浸泡伊紅溶液1 min，蒸餾水反復(fù)沖洗至泛色，常規(guī)脫水，透明并晾干，中性樹膠封片后光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.2.5天狼猩紅染色將薄片常規(guī)脫蠟后滴加天狼星紅染色液置于室溫1 h；流水沖洗至去除切片表面染液，滴加Mayer蘇木精染色液約50 μL/張染細(xì)胞核8 min，蒸餾水沖洗10 min；常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察并采圖。

1.2.6糖原(periodic acid-schiff, PAS)染色將薄片常規(guī)脫蠟后放入蒸餾水浸洗2次×3 min，置于氧化劑中室溫放置6 min。自來水沖洗1次，再用蒸餾水沖洗2次。滴加Schiff溶液后置于室溫，浸染15 min。自來水沖洗1次×10 min。樣本置于蘇木精染色液中，染細(xì)胞核90 s后，放入酸性分化液3 s。自來水沖洗10 min后，放入雙蒸水沖洗至其返藍(lán)。常規(guī)脫水，透明，晾干，封固，顯微鏡下觀察并采圖。

1.2.7免疫組化染色將薄片常規(guī)脫蠟，用蒸餾水沖洗2次×2 min，泡在枸櫞酸抗原修復(fù)液高溫(90～100 ℃)修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫。先后用蒸餾水和PBS緩沖液沖洗1次×5 min，然后3%H2O2溶液室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗 2次×5 min，滴加山羊血清室溫封閉30 min，后滴加一抗 (TGF-β1和α-SMA工作液濃度分別為1∶80和1∶500)4 ℃冰箱孵育過夜。次日復(fù)溫至室溫后PBS液洗3次×5 min，滴加適量二抗稀釋液，室溫孵育90 min后，再用PBS緩沖溶液沖洗3次×5 min。滴加DAB顯色液于光學(xué)顯微鏡下觀察顯色。蘇木精復(fù)染10 s，反復(fù)沖洗，泡鹽酸乙醇分化2～3 s，浸泡蒸餾水反藍(lán)。最后常規(guī)脫水，透明，自然晾干后封固。

2 結(jié) 果

2.1 病理組織學(xué)觀察

2.1.1 HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞邊界清楚,排列整齊,未見炎性細(xì)胞侵潤(rùn)及脂肪變性。模型組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化，泡球蚴感染后1周可見大小及形態(tài)不一的多個(gè)原頭蚴，并其周圍炎性細(xì)胞的集聚。造模后2周顯示，原頭蚴數(shù)目逐漸減少，其周圍炎性帶范圍變大，肝細(xì)胞開始出現(xiàn)脂肪變。4 周時(shí)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞脂肪變性增加,可見肉芽腫和增生的纖維結(jié)締組織。8周后出現(xiàn)大量結(jié)構(gòu)完整的肉芽腫及密集的纖維結(jié)締組織，開始出現(xiàn)膽管增生。至12周，肉芽腫數(shù)量增加的同時(shí)可見完整的泡球蚴囊壁結(jié)構(gòu)，見圖1。

造模后1周時(shí)原頭蚴數(shù)量最多，隨著時(shí)間的推移逐漸被肉芽腫組織取代或形成囊泡，至12周后幾乎消失。肉芽腫組織第2周開始出現(xiàn)，數(shù)目逐漸增加。炎性灶第1周就開始出現(xiàn)在原頭蚴周圍，2周和4周時(shí)范圍逐步擴(kuò)大，到12周時(shí)數(shù)目未見明顯變化，見圖2。

a:對(duì)照組； b-f:分別為模型組感染后1、2、4、8、12周

圖 1 鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)肝組織的變化(HE ×200)

Figure1Changesindifferenttimepointsoflivertissues(HE×200)

圖 2 病灶的分類及數(shù)目

Figure2Classificationandnumberoflesions

2.1.2天狼猩紅染色結(jié)果染色結(jié)果顯示膠原在對(duì)照組肝組織中膽管及血管周圍少量出現(xiàn)；模型組中，感染后前2周膠原主要沉積在原頭蚴周圍，分布疏散，顏色較淺。4周開始沉積逐漸增加并緊密，染色變深；到12周，膠原沉積范圍較前局限，分布密集而顏色深，提示隨著時(shí)間纖維化程度越嚴(yán)重，見圖3。

2.1.3PAS染色結(jié)果結(jié)果顯示對(duì)照組肝組織糖原含量豐富，分布均勻，染色均一。模型組中，感染后1周糖原主要集聚在原頭蚴周圍，集中分布，顏色深。2周和4周時(shí)原頭蚴周圍的糖原陽性染色區(qū)較1周明顯減少，染色變淺。隨后，隨著肉芽腫范圍的增加，糖原陽性區(qū)域越來越減少，染色變淡，肉芽腫組織內(nèi)幾乎不顯示，見圖4。

a:對(duì)照組； b-f:分別為模型組感染后1、2、4、8、12周

圖 3 鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)膠原沉積的情況(天狼星紅染色 ×200)

Figure3Collagendepositionconditionsindifferenttimepoints(Siriusredstaining×200)

a:對(duì)照組； b-f:分別為模型組感染后1、2、4、8、12周

圖 4 鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)肝組織內(nèi)糖原表達(dá)情況(PAS染色 ×200)

Figure4Glycogenexpressionconditionsindifferenttimepointsoflivertissues(PASstaining×200)

2.2免疫組化染色

2.2.1 α-SMA表達(dá)情況α-SMA在對(duì)照組肝組織的陽性表達(dá)主要見于膽管及血管周圍；模型組小鼠肝中的陽性區(qū)多在原頭蚴周圍肉芽腫以及纖維組織增生區(qū)域，周圍新生膽管和血管壁也可見陽性表達(dá)，見圖5。感染后不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA的表達(dá)量隨時(shí)間逐漸增加，見表1。

2.2.2TGF-β1表達(dá)情況結(jié)果顯示TGF-β1在對(duì)照組小鼠肝組織的肝竇區(qū)呈極低水平表達(dá)。模型組小鼠肝組織TGF-β1的表達(dá)部位主要在肝竇區(qū)、肉芽腫組織周圍和泡球蚴生發(fā)層的增生區(qū)。造模后隨著感染時(shí)間的增加，小鼠TGF-β1表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，見圖6。泡球蚴感染后2周內(nèi)TGF-β1的表達(dá)量很低，4 周后有少量表達(dá)，12 周時(shí)達(dá)到最高水平，見表1。

a:對(duì)照組； b-f:分別為模型組感染后1、2、4、8、12周

圖 5 鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA的表達(dá)情況(免疫組化染色 ×200)

Figure5Expressionofα-SMAindifferenttimepointsoflivertissues(IHC×200)

a:對(duì)照組； b-f:分別為模型組感染后1、2、4、8、12周

圖 6 不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)情況(免疫組化染色 ×200)

Figure6ExpressionofTGF-β1indifferenttimepointsoflivertissues(IHC×200)

指標(biāo)對(duì)照組模型組1周2周4周8周12周TGF-β10.29±0.111.02±0.171.83±0.212.03±0.892.99±1.724.10±2.14α-SMA0.61±0.183.35±0.744.92±1.057.03±1.2111.05±1.7116.80±2.09

3 討 論

泡型包蟲病的病理特征主要是導(dǎo)致纖維化和壞死[7]，它的臨床表現(xiàn)與寄生蟲生長(zhǎng)和宿主免疫應(yīng)答都密切相關(guān)。此研究建立泡狀棘球蚴感染的動(dòng)物模型用直接門靜脈注射原頭蚴混懸液的方法，這與人類泡型包蟲自然感染途徑高度相似[2]。因而，建立此模型不僅有利于進(jìn)一步接近自然感染模式來研究肝臟免疫環(huán)境，而且能夠有效顯示泡球蚴感染不同時(shí)間點(diǎn)肝臟的病理變化，為研究泡球蚴感染所致肝損傷及修復(fù)提供了良好的動(dòng)物模型。

寄生蟲與宿主之間的相互作用表現(xiàn)于機(jī)體本身的細(xì)胞免疫和免疫耐受的平衡。當(dāng)寄生蟲導(dǎo)致機(jī)體肝臟損傷時(shí)，在肝細(xì)胞壞死及炎癥的刺激下機(jī)體能夠分泌多種細(xì)胞因子來對(duì)付外來損害而實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：泡球蚴接種后4周小鼠肝臟出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀白色斑塊，12周后肝組織肉眼能夠可見明顯泡球蚴病灶。HE染色及PAS染色提示：泡球蚴感染后1周可見多個(gè)糖原豐富的原頭蚴；2周后肝細(xì)胞開始出現(xiàn)脂肪變性，原頭蚴逐漸被炎性細(xì)胞和肉芽腫包裹，糖原含量隨著下降；對(duì)照組肝組織糖原含量豐富，分布均勻，染色均一，但在模型組中，隨著感染時(shí)間糖原陽性區(qū)域越來越減少，染色變淡。到12周時(shí)肉芽腫數(shù)量和范圍增加的同時(shí)可見完整的泡球蚴生發(fā)層結(jié)構(gòu)，而糖原在肉芽腫組織內(nèi)幾乎不顯示；這表明感染早期侵犯于肝臟內(nèi)的泡球蚴原頭蚴占優(yōu)勢(shì)，并刺激宿主肝臟后在機(jī)體免疫的作用下逐漸被炎癥細(xì)胞包裹，最后被肉芽腫組織取代，只少部分原頭蚴終成為病灶。肝臟作為機(jī)體代謝的主要“陣地”，對(duì)糖原的存儲(chǔ)，分布和調(diào)節(jié)起重要作用，糖類進(jìn)人肝細(xì)胞后經(jīng)葡萄糖激酶被磷酸化為6-磷酸-葡萄糖，進(jìn)一步通過糖原合成酶的合成作用轉(zhuǎn)化為糖原而貯存，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，便可分解成葡萄糖，轉(zhuǎn)化為能量。然而，當(dāng)肝臟受損而肝細(xì)胞發(fā)生彌漫性損害時(shí)，肝糖原合成障礙及貯存減少[8]。多房棘球蚴病通過直接侵蝕、機(jī)械壓迫和毒性損害等方式對(duì)宿主肝臟造成損害，從感染宿主開始到在肝臟內(nèi)形成囊泡、炎性反應(yīng)帶，使病灶處肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死及鈣化，甚至能夠?qū)е聫浡缘睦w維化[2,9]。

肝星狀細(xì)胞在泡球蚴感染所致肝纖維化過程中起著重要的作用，它的活化受TGF-β/Smad通路，MAPK通路等多種信號(hào)通路的調(diào)控[10-15]。研究表明在泡球蚴感染過程中，在蟲卵抗原刺激下宿主產(chǎn)生 TGF-β1等各種細(xì)胞因子，刺激宿主肝星狀細(xì)胞活化、增殖、轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展[16]。TGF-β1目前被認(rèn)為重要的肝纖維化始動(dòng)因子之一。有關(guān)研究證實(shí)機(jī)體在正常狀態(tài)下，肝細(xì)胞內(nèi)不會(huì)表達(dá)TGF-β1；當(dāng)肝細(xì)胞受到損害時(shí)肝細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)上調(diào)[17-18]。Vuitton等[19]發(fā)現(xiàn)TGF-β1在 AE 病人肝組織泡球蚴浸潤(rùn)帶出現(xiàn)陽性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn) TGF-β1在小鼠肝組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示：TGF-β1的表達(dá)部位主要在肝竇區(qū)、肉芽腫組織周圍和泡球蚴生發(fā)層的增生區(qū)，而且隨著感染時(shí)間的增加其表達(dá)逐漸增強(qiáng)；這與泡型包蟲病的臨床特征是一致的。此外，當(dāng)宿主受外界因子刺激時(shí)肝星狀細(xì)胞會(huì)被激活并最終分化為肌成纖維細(xì)胞。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐富的分泌性蛋白，也是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物[20]。本研究結(jié)果提示：接種后不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA的表達(dá)隨著感染時(shí)間逐漸升高，并與對(duì)照組相比有顯著性差異；這與TGF-β1的表達(dá)結(jié)果相似。上述研究結(jié)果證實(shí)泡球蚴感染所致肝纖維化可能與TGF-β1激活肝星狀細(xì)胞相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果中泡球蚴感染的不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肝組織纖維化程度與TGF-β1及α-SMA等相關(guān)因子的表達(dá)趨勢(shì)一致，并與此前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的結(jié)果符合。因此我們認(rèn)為TGF-?1可能通過活化肝星狀細(xì)胞并促使其轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞，后者通過分泌 a-SMA蛋白，進(jìn)而促進(jìn)膠原蛋白沉積并導(dǎo)致纖維化。然而，調(diào)控TGF-β1的表達(dá)可能影響泡球蚴所致肝纖維化，可為今后泡型包蟲病肝纖維化治療和臨床藥物的開發(fā)提供良好的理論依據(jù)和新的思路。