何德肆，李海輝，顏 愛，彭蘭麗，曾 煥

（1.湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南豬衛(wèi)士科技服務(wù)有限公司，湖南 長沙 410128）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhoea，PED）是 由 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性、高度傳染性腸道病毒性疾病。PEDV通過感染腸道上皮細(xì)胞，引起仔豬腹瀉、脫水及高死亡率。2010年P(guān)EDV在我國的再次流行給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱“豬藍耳病”，是由豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙及各階段豬呼吸障礙為特征的傳染病。這個高度可變的RNA病毒是在近30年前被發(fā)現(xiàn)的，盡管進行了廣泛的研究，其仍然在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是養(yǎng)豬業(yè)面臨的一大難題[2-3]。

相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明[4-5]，豬感染PRRSV有利于PEDV在豬場的流行，而豬感染PEDV后，繼發(fā)PRRS則會加劇豬只死亡率。近年來雖少有混合感染PRRSV、PEDV的相關(guān)案例報道，但需加強重視。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病情況

2018年11月，湖南郴州某規(guī)模豬場（存欄母豬300頭）新生2～4 d仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉，發(fā)病率70%，死亡率50%。推測由PEDV引起，采用免疫、補液等措施，疫情有所控制；3周后新生仔豬再次出現(xiàn)腹瀉，母豬伴隨高熱、厭食癥狀，同樣防控方案無效，仔豬死亡率高達90%。為確診，剖檢2頭發(fā)病豬，取其相應(yīng)組織送往實驗室進行豬藍耳病、豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎及輪狀病毒的診斷。

1.2 試驗材料

1.2.1 病料采集

豬肺臟、扁桃體、淋巴結(jié)、小腸組織。

1.2.2 試驗試劑

即用型PCR試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit購自美國康寧生命科學(xué)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及測序由華大基因公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 病毒基因PCR擴增檢測

剪取適量組織充分研磨后，按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit試劑盒說明書的操作步驟提取病毒基因組，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的病毒基因組進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。設(shè)計引物檢測PEDV、TGEV、RV、PRRSV，引物序列見表1，PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用紫外凝膠成像儀分析。

1.3.2 基因測序分析

根據(jù)1.3.1檢測結(jié)果，設(shè)計檢測PRRSV Nsp2、PEDV ORF3基因引物用于病毒測序，引物序列見表1，測序由華大基因完成。

2 試驗結(jié)果

2.1 病毒PCR結(jié)果

用鑒別診斷豬經(jīng)典與變異藍耳病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒的特異性引物進行PCR擴增，由圖1-圖4可知，從病料中擴增出了與變異豬藍耳病病毒和豬流行性腹瀉病毒相符合的目的條帶，未檢測到傳染性胃腸炎病毒及輪狀病毒。

2.2 測序分析結(jié)果

為確定分離株是否為變異毒株，設(shè)計相應(yīng)引物進行測序分析，結(jié)果見圖5、圖6。在PRRSV粒子中，最為保守的蛋白為M蛋白，其次是N蛋白，變異最為顯著的是Nsp2、GP3、GP5，因此，在進行PRRSV進化分析時，常用M、N及Nsp2進行分析。此案例中選用Nsp2進行測序比對分析，由圖5可知，分離株（稱為PRRSV isolate）與JXA1等其他高致病性毒株同源性較高，與經(jīng)典毒株BJ4、VR2332及類NADC30毒株相距較遠(yuǎn)，為高致病性毒株。

表1 引物列表

PEDV ORF3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，其可用來進行PEDV分子流行病學(xué)研究，從圖6可知，案例分離毒株（PEDV isolate）與經(jīng)典毒株CV777相距甚遠(yuǎn)，隸屬于2010年出現(xiàn)的變異毒株，根據(jù)分類[6]，其隸屬于GⅡb群。

3 分析

豬流行性腹瀉是由PEDV引起的一種嚴(yán)重危害豬生產(chǎn)的病毒性傳染病，自2010年以來，PED在我國不同地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)造成了重大經(jīng)濟損失，據(jù)統(tǒng)計部分豬場產(chǎn)房新生仔豬死亡率高達100%。遺傳進化分析顯示，2010年后新出現(xiàn)毒株與之前毒株（代表株CV777）有顯著差異。對來自不同國家上傳的409株全基因序列進行分析，進化樹結(jié)果顯示PEDV可分為2個群：GI（經(jīng)典）和GII（變異），2010年后在全球高度流行的PEDV毒株大部分隸屬于GII基因群，而GII群又可分為3個亞群（GII-a、GII-b、GII-c）[7]。在此案例中所分離到的毒株經(jīng)測序分析與GII-b高度同源，為變異毒株。

PRRS是由PRRSV引起的一種以母豬發(fā)熱、厭食和流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。2006年，新出現(xiàn)的高致病性PRRSV導(dǎo)致大量豬只死亡，2012年，NADC30-like毒株的出現(xiàn)和流行，以及不同毒株間的重組變異，使得豬藍耳病一直是我國乃至全球養(yǎng)豬業(yè)面臨的一大難題[8]。此案例分離毒株與JXA1毒株高度同源，為高致性毒株。

根據(jù)近幾年文獻調(diào)查，豬藍耳病和豬流行性腹瀉的混合感染相對較低，但其混合感染所造成的影響不容小覷。研究人員對生長育肥豬人工接種PRRSV和PEDV，結(jié)果顯示PRRSV+PEDV混合感染組平均日增重、平均日采食量、料重比、及主要養(yǎng)分及能量的表觀全消化道消化率低于單獨感染組及對照組，盡管單獨感染PRRSV不會改變豬腸道形態(tài)及完整性，但在感染PEDV后再混合感染PRRSV，PRRSV將加重腸道損傷程度[9-10]。PRRSV和PEDV均是近年來影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要病原，對于其混合感染的研究也較少，但對于豬場管理人員，需密切關(guān)注場內(nèi)PRRSV、PEDV的感染動態(tài)，在發(fā)生新生仔豬腹瀉疫情時，需警惕豬藍耳病的混合或繼發(fā)感染，從而避免重大的經(jīng)濟損失。