何德肆，李海輝，顏 愛，彭蘭麗，曾 煥

（1.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南豬衛(wèi)士科技服務(wù)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhoea，PED）是 由 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性、高度傳染性腸道病毒性疾病。PEDV通過感染腸道上皮細(xì)胞，引起仔豬腹瀉、脫水及高死亡率。2010年P(guān)EDV在我國(guó)的再次流行給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙及各階段豬呼吸障礙為特征的傳染病。這個(gè)高度可變的RNA病毒是在近30年前被發(fā)現(xiàn)的，盡管進(jìn)行了廣泛的研究，其仍然在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是養(yǎng)豬業(yè)面臨的一大難題[2-3]。

相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明[4-5]，豬感染PRRSV有利于PEDV在豬場(chǎng)的流行，而豬感染PEDV后，繼發(fā)PRRS則會(huì)加劇豬只死亡率。近年來(lái)雖少有混合感染PRRSV、PEDV的相關(guān)案例報(bào)道，但需加強(qiáng)重視。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病情況

2018年11月，湖南郴州某規(guī)模豬場(chǎng)（存欄母豬300頭）新生2～4 d仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉，發(fā)病率70%，死亡率50%。推測(cè)由PEDV引起，采用免疫、補(bǔ)液等措施，疫情有所控制；3周后新生仔豬再次出現(xiàn)腹瀉，母豬伴隨高熱、厭食癥狀，同樣防控方案無(wú)效，仔豬死亡率高達(dá)90%。為確診，剖檢2頭發(fā)病豬，取其相應(yīng)組織送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行豬藍(lán)耳病、豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎及輪狀病毒的診斷。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 病料采集

豬肺臟、扁桃體、淋巴結(jié)、小腸組織。

1.2.2 試驗(yàn)試劑

即用型PCR試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit購(gòu)自美國(guó)康寧生命科學(xué)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及測(cè)序由華大基因公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病毒基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)

剪取適量組織充分研磨后，按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit試劑盒說明書的操作步驟提取病毒基因組，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的病毒基因組進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。設(shè)計(jì)引物檢測(cè)PEDV、TGEV、RV、PRRSV，引物序列見表1，PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用紫外凝膠成像儀分析。

1.3.2 基因測(cè)序分析

根據(jù)1.3.1檢測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)檢測(cè)PRRSV Nsp2、PEDV ORF3基因引物用于病毒測(cè)序，引物序列見表1，測(cè)序由華大基因完成。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 病毒PCR結(jié)果

用鑒別診斷豬經(jīng)典與變異藍(lán)耳病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖1-圖4可知，從病料中擴(kuò)增出了與變異豬藍(lán)耳病病毒和豬流行性腹瀉病毒相符合的目的條帶，未檢測(cè)到傳染性胃腸炎病毒及輪狀病毒。

2.2 測(cè)序分析結(jié)果

為確定分離株是否為變異毒株，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果見圖5、圖6。在PRRSV粒子中，最為保守的蛋白為M蛋白，其次是N蛋白，變異最為顯著的是Nsp2、GP3、GP5，因此，在進(jìn)行PRRSV進(jìn)化分析時(shí)，常用M、N及Nsp2進(jìn)行分析。此案例中選用Nsp2進(jìn)行測(cè)序比對(duì)分析，由圖5可知，分離株（稱為PRRSV isolate）與JXA1等其他高致病性毒株同源性較高，與經(jīng)典毒株BJ4、VR2332及類NADC30毒株相距較遠(yuǎn)，為高致病性毒株。

表1 引物列表

PEDV ORF3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，其可用來(lái)進(jìn)行PEDV分子流行病學(xué)研究，從圖6可知，案例分離毒株（PEDV isolate）與經(jīng)典毒株CV777相距甚遠(yuǎn)，隸屬于2010年出現(xiàn)的變異毒株，根據(jù)分類[6]，其隸屬于GⅡb群。

3 分析

豬流行性腹瀉是由PEDV引起的一種嚴(yán)重危害豬生產(chǎn)的病毒性傳染病，自2010年以來(lái)，PED在我國(guó)不同地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)統(tǒng)計(jì)部分豬場(chǎng)產(chǎn)房新生仔豬死亡率高達(dá)100%。遺傳進(jìn)化分析顯示，2010年后新出現(xiàn)毒株與之前毒株（代表株CV777）有顯著差異。對(duì)來(lái)自不同國(guó)家上傳的409株全基因序列進(jìn)行分析，進(jìn)化樹結(jié)果顯示PEDV可分為2個(gè)群：GI（經(jīng)典）和GII（變異），2010年后在全球高度流行的PEDV毒株大部分隸屬于GII基因群，而GII群又可分為3個(gè)亞群（GII-a、GII-b、GII-c）[7]。在此案例中所分離到的毒株經(jīng)測(cè)序分析與GII-b高度同源，為變異毒株。

PRRS是由PRRSV引起的一種以母豬發(fā)熱、厭食和流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。2006年，新出現(xiàn)的高致病性PRRSV導(dǎo)致大量豬只死亡，2012年，NADC30-like毒株的出現(xiàn)和流行，以及不同毒株間的重組變異，使得豬藍(lán)耳病一直是我國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)面臨的一大難題[8]。此案例分離毒株與JXA1毒株高度同源，為高致性毒株。

根據(jù)近幾年文獻(xiàn)調(diào)查，豬藍(lán)耳病和豬流行性腹瀉的混合感染相對(duì)較低，但其混合感染所造成的影響不容小覷。研究人員對(duì)生長(zhǎng)育肥豬人工接種PRRSV和PEDV，結(jié)果顯示PRRSV+PEDV混合感染組平均日增重、平均日采食量、料重比、及主要養(yǎng)分及能量的表觀全消化道消化率低于單獨(dú)感染組及對(duì)照組，盡管單獨(dú)感染PRRSV不會(huì)改變豬腸道形態(tài)及完整性，但在感染PEDV后再混合感染PRRSV，PRRSV將加重腸道損傷程度[9-10]。PRRSV和PEDV均是近年來(lái)影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要病原，對(duì)于其混合感染的研究也較少，但對(duì)于豬場(chǎng)管理人員，需密切關(guān)注場(chǎng)內(nèi)PRRSV、PEDV的感染動(dòng)態(tài)，在發(fā)生新生仔豬腹瀉疫情時(shí)，需警惕豬藍(lán)耳病的混合或繼發(fā)感染，從而避免重大的經(jīng)濟(jì)損失。