杜毅超， 張 浩， 仲富瑞， 程宦立， 賴 莉， 錢保林， 譚 鵬， 夏先明， 付文廣

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a. 四川省院士(專家)工作站； b. 肝膽外科， 四川 瀘州 646000

藥物性肝損傷是指由各種藥物、草藥或其他外源性藥物引起的肝臟指標(biāo)檢查異?；蚋喂δ苷系K[1]。對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一種常用的解熱鎮(zhèn)痛類非處方藥，過量APAP誘導(dǎo)的肝毒性仍然是急性肝衰竭最常見的病因[2]。氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙是APAP致肝損傷的重要機(jī)制[3]。趕黃草(Penthorum Chinense Pursh)為虎耳草科(Saxifragaceae)扯根菜屬苗族地區(qū)藥食兩用植物[4]。趕黃草水煎劑已傳承千年并被制成肝蘇顆粒用于治療慢性活動(dòng)性肝炎、急慢性乙型肝炎等肝臟疾病[5]，其主要活性成分喬松素(pinocembrin，PIN)對(duì)肝纖維化[6]、感染性休克、癌癥、心血管病等疾病有治療作用，此外，PIN已被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于腦缺血中風(fēng)患者的臨床治療，并已進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)研究[7]。但未見其運(yùn)用于急性肝病的研究，特別是藥物性肝損傷的研究。本實(shí)驗(yàn)通過建立APAP小鼠藥物性肝損傷模型，探究給予不同劑量PIN處理后各項(xiàng)生化指標(biāo)變化，探討PIN對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠50只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(川)2015-030。本研究方案經(jīng)由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：201906-50)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

1.2 主要試劑 PIN(純度≥98%)由大連醫(yī)科大學(xué)從趕黃草提取并提供；ALT、AST、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)、全光譜分光光度計(jì)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；恒溫水浴鍋購(gòu)自美國(guó)Polyscience公司；正置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；超純水機(jī)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及處理 將50只C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成5組：空白組、PIN(50 mg/kg)組、APAP(300 mg/kg)模型組、PIN(30 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)實(shí)驗(yàn)組、PIN(50 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)實(shí)驗(yàn)組，每組10只。各組采取灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水，PIN組及PIN+APAP組每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥2 h后，模型組和PIN+APAP組腹腔注射APAP 300 mg/kg 1次，空白組和PIN組腹腔注射等量生理鹽水。APAP處理24 h后收集血清及肝臟用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 各組小鼠摘眼球取血于1000 g 4 ℃離心7 min分離血清，置于-80 ℃保存待用。以相應(yīng)試劑盒檢測(cè)ALT和AST。

1.4.3 肝組織中MDA、SOD和谷胱甘肽(glutathione, GSH)檢測(cè) 取小鼠肝組織置于生理鹽水中勻漿后，于4000 r/min 4 ℃離心15 min收集上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組肝組織中MDA、SOD和GSH水平。

1.4.4 組織學(xué)分析 用4%的多聚甲醛固定小鼠左側(cè)部分肝葉，經(jīng)過石蠟包埋、切片、HE染色，在顯微鏡下觀察肝臟組織損傷情況。

2 結(jié)果

2.1 PIN對(duì)APAP致肝損傷小鼠模型血清中ALT、AST水平的影響 與空白組比校，APAP(300 mg/kg)模型組的ALT、AST水平均顯著升高(P值均<0.01)，模型構(gòu)建成功；PIN(30 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)及PIN(50 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)組的ALT、AST與APAP(300 mg/kg)模型組相比均顯著降低(P值均<0.01)(表1)。

表1 5組間各指標(biāo)的比較

注：與空白組比較，1)P<0.01；與APAP(300 mg/kg)模型組比較，2)P<0.05。

2.2 PIN對(duì)APAP致肝損傷小鼠模型肝組織中MDA、SOD和GSH的影響 與空白組比校，APAP(300 mg/kg)模型組小鼠肝臟中MDA的水平顯著升高(P<0.01)，且SOD活性及GSH水平顯著降低(P值均<0.01)；與APAP(300 mg/kg)模型組比較，PIN(30 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)及PIN(50 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)組的小鼠肝臟中MDA的水平顯著降低(P值均<0.05)，且SOD活性及GSH水平顯著升高(P值均<0.05)(表1)。

2.3 PIN對(duì)APAP致肝損傷小鼠模型肝組織病理的影響 空白組及PIN(50 mg/kg)組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝索排列整齊規(guī)則，肝細(xì)胞核居中界限明晰，肝細(xì)胞未見壞死及無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；APAP(300 mg/kg)模型組可見肝組織嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞間界限不清，肝細(xì)胞灶性或大面積壞死排列紊亂，肝細(xì)胞大面積壞死，細(xì)胞核被擠向一邊，表明藥物性肝損傷模型成功；與APAP(300 mg/kg)模型組比較，PIN(30 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)及PIN(50 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)組的小鼠肝臟病變明顯緩解，肝組織炎癥浸潤(rùn)輕微，細(xì)胞輪廓仍清晰可見，未見到大面積壞死灶(圖1)。表明PIN對(duì)緩解藥物性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

注：a，空白組；b，PIN(50 mg/kg)組；c，APAP(300 mg/kg)模型組；d，PIN(30 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)；e，PIN(50 mg/kg)+APAP(300 mg/kg)。

圖1肝組織病理結(jié)果(HE染色，×200)

3 討論

APAP過量是許多發(fā)達(dá)國(guó)家藥物性肝衰竭的主要原因[8]。當(dāng)過量的APAP破壞肝細(xì)胞防御機(jī)制時(shí)，過多的活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷發(fā)生的主要驅(qū)動(dòng)因素[9]。因此，調(diào)控肝內(nèi)氧化應(yīng)激可能為APAP致藥物性肝損傷的有效治療開辟新的途徑。

評(píng)價(jià)肝功能情況最常用的指標(biāo)是ALT、AST，當(dāng)肝細(xì)胞受到損害后細(xì)胞膜的通透性增大，胞內(nèi)的ALT、AST穿過細(xì)胞膜進(jìn)入血液，血液中的ALT、AST水平顯著升高[10]。本研究小鼠經(jīng)APAP造模后，血清中的ALT、AST水平顯著升高，表明藥物性肝損傷模型建立成功，而通過各劑量的PIN預(yù)處理可使APAP誘發(fā)的高水平AST、ALT的顯著降低，初步表明PIN經(jīng)口服可緩解小鼠模型的藥物性肝損傷。

此外，大約10%的APAP被細(xì)胞色素P450酶氧化為其化學(xué)活性代謝物，可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的肝損傷[11]。重要的代謝物被稱為苯醌亞胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine, NAPQI)，NAPQI有毒，可與谷胱甘肽(glutathione, GSH)結(jié)合失去毒性[12]。當(dāng)APAP過量時(shí)，可使NAPQI的積累，導(dǎo)致GSH的利用率增加，GSH被消耗殆盡，未與GSH結(jié)合的多余NAPQI可能與細(xì)胞蛋白(包括線粒體蛋白)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致肝功能衰竭[13]。Saad等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PIN預(yù)處理可通過增加GSH水平減弱大鼠全腦缺血再灌注損。Promsan等[15]研究表明，PIN可通過降低MDA水平減輕慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠腎毒性。范玲等[16]用趕黃草70%乙醇提取物處理小鼠內(nèi)毒素肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)其可能通過減少TNFα產(chǎn)生并調(diào)控ROS/NLRP3/IL-1β通路起保護(hù)作用。血紅素加氧酶是機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷的重要分子之一，Punvittayagul等[17]利用PIN處理大鼠可顯著提高血紅素加氧酶的活性。在本研究中，小鼠腹腔注射大劑量的APAP后，肝組織中MDA顯著增加，SOD及GSH水平顯著降低，表明大劑量的APAP可使小鼠的肝臟抗氧化防御能力失去，發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷。而通過口服不同劑量的PIN再用APAP處理，相比僅用APAP處理，小鼠肝組織中MDA顯著降低，SOD及GSH的水平明顯回升，表明PIN可明顯提高肝組織的抗氧化能力，抑制過量APAP對(duì)小鼠肝組織的氧化損傷。

綜上所述，從趕黃草中提取的PIN單體可明顯緩解APAP誘發(fā)的藥物性肝損傷，提示PIN可能是一種具有明顯保肝護(hù)肝作用的候選藥物，作用機(jī)制可能與其抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。這對(duì)明確中藥的療效及作用機(jī)理奠定了一定基礎(chǔ)。