潘書賢，肖昌浩，黃 皓，胡文濤

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護學(xué)院， 放射醫(yī)學(xué)與輻射防護國家重點實驗室， 江蘇省高校放射醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心， 蘇州 215123)

肝癌在全世界的致死性癌癥中排名第三，每年有將近750 000名新增病例[1]。在過去的幾十年間，肝癌潛在的流行病學(xué)危險因素一直在增加[2]。隨著肝癌的影像診斷，外科手術(shù)和肝移植等技術(shù)取得了巨大的進步，肝癌患者的生存率也出現(xiàn)大幅度的提高。然而，肝癌患者的預(yù)后情況卻仍然不理想[3]。大約有60%的肝癌病人需要接受放療，但是，肝癌卻被認(rèn)為是一種輻射抗性腫瘤，其放療效果并不理想，五年生存率只有3%～5%[4]。因此，找到調(diào)控肝癌輻射敏感型的目標(biāo)分子對于提高肝癌的輻射敏感性和改善放療效果是很有必要的。

晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)蛋白(period circadian regulator 1, PER1)是調(diào)節(jié)生物節(jié)律的時鐘蛋白，作為生物節(jié)律負(fù)反饋調(diào)節(jié)原件參與生物節(jié)律的調(diào)節(jié)，PER1蛋白主要集中在細(xì)胞質(zhì)中與另一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白隱花色素受體(cryptochrome,CRY)結(jié)合形成復(fù)合體，形成的復(fù)合體進一步被PER蛋白激酶CK1酶磷酸化，然后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核與CLOCK:BMAL1結(jié)合來抑制其功能，從而對生物節(jié)律產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)[5-7]。除此之外，Per1基因編碼的蛋白還是生物節(jié)律調(diào)節(jié)的重要限制原件，能夠重置生物節(jié)律時相[8,9]。PER1蛋白的表達(dá)水平隨著生物節(jié)律的波動而變化，而且PER1自身節(jié)律的變化在生物節(jié)律功能的發(fā)揮構(gòu)成中也是必要的[10]。Niu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高水平表達(dá)PER1的膠質(zhì)瘤組織對X射線的敏感性較高，并且在高水平表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，X射線引起的凋亡明顯增多，此外，研究還發(fā)現(xiàn)，X射線能夠促進PER1的表達(dá)，但是在正常組織中并未觀察到類似現(xiàn)象。這提示PER1與腫瘤組織的輻射敏感性有關(guān)，然而，其與肝癌細(xì)胞輻射敏感性的關(guān)系還未曾報道，并且PER1參與調(diào)節(jié)腫瘤輻射敏感性的具體機制尚不明確。

在本次研究中，我們通過檢測PER1蛋白以及其mRNA在輻射敏感性不同的肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，同時也通過試驗驗證PER1蛋白在肝癌細(xì)胞輻射敏感性中的作用，對PER1增強肝癌細(xì)胞輻射敏感性的潛在機制進行了初步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PER1能夠增強肝癌細(xì)胞的輻射敏感性。本次研究也為進一步提高肝癌的放療效果提供了試驗基礎(chǔ)。

qRT-PCR用來檢測RA患者滑膜組織P2X7受體和MH7A細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6相對表達(dá)水平。實驗步驟如下：收集處理好滑膜組織或MH7A細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，用SYBER green試劑盒進行實時熒光PCR實驗。PCR條件為：96℃ 30 s，1個循環(huán)；PCR反應(yīng)，96 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，45個循環(huán)；溶解，96 ℃ 15 s，65℃ 20s，96 ℃15s，1個循環(huán)。PCR結(jié)束后，根據(jù)相應(yīng)的公式，以標(biāo)準(zhǔn)曲線進行校正，計算出mRNA的相對表達(dá)。

貴州骨干水源工程建設(shè)任重道遠(yuǎn)，肩負(fù)著解決全省工程性缺水問題的重任。國發(fā)〔2012〕2號文件明確提出：在安排中央財政轉(zhuǎn)移支付和中央預(yù)算內(nèi)投資時，加大對貴州水利建設(shè)投入力度，支持貴州如期完成“三位一體”綜合規(guī)劃提出的水利建設(shè)目標(biāo)。因此，在國家財政和地方財政提供基礎(chǔ)保障的前提下，充分利用好各項優(yōu)惠政策，以省級水利融資平臺為主，短期內(nèi)主要依靠金融機構(gòu)貸款，中遠(yuǎn)期采取金融機構(gòu)貸款、上市融資、發(fā)行企業(yè)債券等方式融資，可以建立起貴州省骨干水源工程建設(shè)投入穩(wěn)定增長機制。

用雙尾t檢驗分析兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計學(xué)差異，用SPSS9.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析。不同組間比較方差齊性，相同指標(biāo)兩處理組或者多處理組間比較經(jīng)正態(tài)性檢驗后符合正態(tài)分布再用t檢驗，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，于對數(shù)生長期根據(jù)試驗說明書進行PER1過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染，每孔載體用量為5 000 ng，Lipo3000脂質(zhì)體用量為3.75 μL。轉(zhuǎn)染后過5 h吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并更換無轉(zhuǎn)染試劑的正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，BEL-7402和HepG2為本實驗室保存細(xì)胞。胎牛血清，青霉素-鏈霉素抗生素混合液，DMEM高糖培養(yǎng)基和RPM1640培養(yǎng)基均購買自美國GIBCO公司。Trypsin-EDTA，BCA蛋白定量試劑盒購買自Bio SHARP生物科技公司。PER1蛋白抗體(鼠抗)購買自美國CST公司。細(xì)胞凋亡試劑盒、p53、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠和一抗稀釋液購買自上海碧云天生物技術(shù)公司。PER1過表達(dá)載體(pcDNA3.1-PER1)由上海生工設(shè)計并構(gòu)建。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買自Takara公司，定量PCR試劑盒購買自康潤生物。SMMC-7721，HepG2用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，BEL-7402用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，均培養(yǎng)于5%CO2，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。X射線照射采用美國RAD SOURCE RS-2000X射線儀，劑量率為1.2 Gy/min，細(xì)胞照射劑量為0、2、4、6、8、10 Gy，細(xì)胞均培養(yǎng)于直徑60 mm的平板培養(yǎng)皿中進行照射。

克隆形成試驗用來檢測過表達(dá)PER1的BEL-7402細(xì)胞系接受X射線照射后的存活情況。具體方法為接種100、200、400、800、2 000、5 000個細(xì)胞于直徑60 mm培養(yǎng)皿中，分別對應(yīng)X射線劑量為0、2、4、6、8、10 Gy，然后于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，接著吸去培養(yǎng)基，用70%乙醇固定后結(jié)晶紫染色，計數(shù)克隆。試驗重復(fù)3次?？寺⌒纬陕?克隆集落數(shù)量/接種細(xì)胞數(shù)量×100%。存活曲線利用Graphpad軟件繪制。

(3)某工業(yè)廢水中含有少量的As2O3,向該廢水中通入硫化氫可將其轉(zhuǎn)化為更難溶的As2S3,該反應(yīng)的化學(xué)方程式為____。

1.3 蛋白免疫印跡

TRIzol試劑裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，PER1的mRNA表達(dá)通過GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，試驗重復(fù)3次。

1.4 實時熒光定量PCR

RIPA裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量，聚丙烯酰胺凝膠中添加蛋白為50 μg，以蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為參照，確定目的蛋白的位置，電泳起始電壓為80 V，待樣品到達(dá)分離膠后提高電壓至120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑將要跑到凝膠底部時，停止電泳。然后在200 mA，90 min條件下將凝膠中的蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。接下來用PBST配置的5%牛奶封閉1 h，加入PER1一抗4 ℃過夜。PBST洗膜8遍，每遍5 min，加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，用PBST洗膜8次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，拍照。最后用Image J軟件進行灰度值定量分析。試驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡分析

如圖1所示，在照射劑量為0、2、4、6、8、10 Gy情況下，SMMC-7721、BEL-7402和HepG2細(xì)胞的存活率都隨著劑量的增加出現(xiàn)降低的趨勢。其中SMMC-7721在三種細(xì)胞系中對輻射最敏感，BEL-7402的輻射抗性在三種肝癌細(xì)胞系中最高(BEL-7402與HepG2相比P<0.01；與SMMC-7721相比P<0.001)。

1.6 克隆形成試驗以及存活曲線的繪制

四只表演虎間隔2米，成東西方向一字排開，臥于表演場地北側(cè)中央，頭南尾北，所有表演者立于虎后，擊鼓人員位于東北方向。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

孩子不在身邊，所幸老人還有個學(xué)生，跟進跟出地伺候他。許多人都說：“看這年輕人，放著自己的正事不干，成天陪著老頭子，好像很孝順的樣子。誰不知道，他是為了老頭子的錢。”

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞存活曲線

消化對數(shù)生長期的BEL-7402肝癌細(xì)胞，接種于6孔板，每孔接種細(xì)胞數(shù)為3×105個，轉(zhuǎn)染PER1過表達(dá)載體，5 h后換液，24 h后用5 Gy X射線照射，照射后24 h檢測細(xì)胞凋亡情況。

圖1 SMMC-7721，HepG2，BEL-7402三種肝癌細(xì)胞系在不同劑量下的存活曲線Fig.1 Survival curves of SMMC-7721, HepG2, BEL-7402 cells exposed to X-ray irradiation of gradient doses*：P<0.05；** ：P<0.01；*** ：P<0.001*:P<0.05,** :P<0.01,*** :P<0.001

2.2 蛋白免疫印跡試驗和實時熒光定量PCR試驗

經(jīng)過照射后發(fā)現(xiàn)BEL-7402對射線的抗性明顯強于SMMC-7721和HepG2。三種細(xì)胞系中SMMC-7721的輻射敏感性最強，我們選用BEL-7402和SMMC-7721兩種細(xì)胞檢測PER1蛋白的表達(dá)。蛋白免疫印跡結(jié)果示于圖2。由圖2可見，BEL-7402中PER1蛋白表達(dá)水平明顯低于SMMC-7721細(xì)胞中的PER1表達(dá)(圖2a、2b，P<0.01)。類似的結(jié)果也在定量PCR結(jié)果中得到驗證，如圖2c所示，P<0.05。

圖2 PER1在SMMC-7721，HepG2，BEL-7402三種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.2 The expression of PER1 in SMMC-7721, HepG2, BEL-7402 cells(a,b)PER1蛋白在三種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及灰度值檢測；(c)PER1 mRNA 在三種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)。*：P<0.05,** ：P<0.01(a,b)Expression of PER1 protein in the 3 hepatoma carcinoma cell lines;(c)Expression of PER1 mRNA in the 3 hepatocellular cell lines.*:P<0.05,** :P<0.01

2.3 過表達(dá)PER1蛋白后的細(xì)胞存活曲線

PER1在BEL-7402和SMMC-7721的表達(dá)結(jié)果顯示，在輻射抗性更高的BEL-7402細(xì)胞系中PER1表達(dá)水平很低，因此我們選用BEL-7402細(xì)胞系研究PER1的輻射增敏作用，結(jié)果如圖3所示，過表達(dá)PER1后，BEL-7402細(xì)胞系中PER1蛋白表達(dá)明顯升高，RT-qPCR試驗也得到了同樣的結(jié)果(圖3中a～c，P<0.001)。過表達(dá)PER1的BEL-7402細(xì)胞接受0、2、4、6、8、10 Gy梯度劑量照射處理后，細(xì)胞克隆存活率明顯低于未接受PER1過表達(dá)處理的對照組(圖3d，P<0.001)。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測

根據(jù)圖2試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PER1在BEL-7402中的表達(dá)明顯低于SMMC-7721和HepG2，為了觀察PER1在肝癌細(xì)胞系輻射敏感性中的作用，接下來對BEL-7402進行過表達(dá)PER1處理，并檢測PER1對X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖4a和4b所示，接受X射線照射以后，過表達(dá)PER1的BEL-7402細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.01)。

圖3 BEL-7402過表達(dá)PER1后不同輻照劑量下的存活曲線PER1Fig.3 Survival curves of BEL-7402 cells overexpressing PER1 after irradiation(a～c) BEL-7402過表達(dá)PER1后其蛋白及mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)；(d) 過表達(dá)PER1后BEL-7402肝癌細(xì)胞在不同劑量X射線照射下的存活分?jǐn)?shù)。PER1-OE：過表達(dá)PER1的BEL-7402肝癌細(xì)胞系；Control：未經(jīng)過表達(dá)處理的BEL-7402肝癌細(xì)胞系。*** ：P<0.001 (a～c)Verification of PER1 overexpression in BEL-7402 cells by western blot and RT-qPCR;(d)Survival fraction of BEL-7402 cells under different doses of X-rays after overexpression of PER1. PER1-OE:BEL-7402 cells overexpressing PER1；Control:BEL-7402 cells untreated with overexpression. *** :P<0.001

2.5 免疫印跡試驗

為了研究PER1在增強X射線誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡中的機制，接下來對過表達(dá)PER1的BEL-7402細(xì)胞進行X射線照射處理。根據(jù)圖1結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報道，選取5 Gy的劑量進行照射，照射后24 h檢測細(xì)胞水平抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3以及p53的表達(dá)水平。結(jié)果表明，過表達(dá)PER1后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低，而凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3斷裂增多，同時p53表達(dá)明顯升高(圖5中a～d，P<0.01)。

圖4 BEL-7402過表達(dá)PER1后細(xì)胞凋亡的檢測Fig.4 Apoptosis rate of BEL-7402 cells overexpressing PER1 after irradiation(a)凋亡流式檢測結(jié)果；(b)凋亡率統(tǒng)計。PER1-OE：過表達(dá)PER1的BEL-7402肝癌細(xì)胞系；Control：未經(jīng)過表達(dá)處理的BEL-7402肝癌細(xì)胞系。** ：P<0.01(a)Representative images of cytometry analysis;(b)Statistical results of apoptosis rates.PER1-OE:BEL-7402 cells overexpressing PER1；Control:BEL-7402 cells untreated with overexpression. ** :P<0.01

圖5 過表達(dá)PER1的BEL-7402接受X射線照射后24 h凋亡相關(guān)蛋白檢測Fig.5 Detection of apoptosis related proteins in BEL-7402 cells overexpressing PER1 after irradiation(a)Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)；(b～d) 蛋白灰度值定量分析。PER1-OE：過表達(dá)PER1的BEL-7402肝癌細(xì)胞系；Control：未經(jīng)過表達(dá)處理的BEL-7402肝癌細(xì)胞系。*** ：P<0.001 (a)Expression of Bcl-2 and cleaved caspase3 proteins;(b～d):Quantitative analysis of protein gray values. PER1-OE:BEL-7402cells overexpressing PER1;Control:BEL-7402 cells untreated with overexpression. *** :P<0.001

3 討論

肝癌的有效治療手段包括經(jīng)皮注射無水乙醇治療、高頻消融、外科手術(shù)切除等方法。非外科治療手段，例如動脈栓塞療法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床中外科手術(shù)不能切除的肝癌[12]。放療作為肝癌非外科治療手段之一，雖然效果有待改善，但是能夠有效地幫助病人取得較好的臨床緩解[13]。在肝癌臨床放療中通過限制照射劑量來減少射線對正常肝臟的損害，這是由正常肝臟細(xì)胞對射線的低耐受性以及肝癌細(xì)胞自身的抗性所決定的。然而，隨著劑量的減少，肝癌細(xì)胞的殺傷作用也隨之減弱[14]。時鐘蛋白已經(jīng)被證明在多種腫瘤中異常表達(dá)[15,16]。PER1作為時鐘蛋白的一種，其功能主要是調(diào)節(jié)大腦和外周組織的多種生物進程。PER1通過與CRY形成復(fù)合體，參與到生物節(jié)律的調(diào)節(jié)中，二者形成的復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可被磷酸化酶降解。除此之外，PER1與CRY形成的符合體與CLOCK:BMAL1復(fù)合體相互作用，從而抑制CLOCK:BMAL1復(fù)合體的功能來延長生物節(jié)律周期，從而影響生物節(jié)律功能[7,17-19]。研究表明過表達(dá)PER蛋白家族會使小鼠更容易發(fā)生腫瘤，并且對射線敏感[20]，而低氧造成的PER蛋白的降低，會增加細(xì)胞自身上皮轉(zhuǎn)化的功能[21]。另有研究證明PER1的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系[22]，有試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PER1和PER2作為時鐘基因的調(diào)節(jié)原件，在正常的人大腦和膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平都具有節(jié)律性，但是在兩種組織中，生物鐘的變化情況也是不同的。具體表現(xiàn)就是在膠質(zhì)瘤中生物周期為12 h，但是在正常人腦中的生物周期為24 h[23]。在本次研究中，對PER1在輻射抗性不同的三種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)輻射抗性越高PER1的表達(dá)水平越低。然后對低表達(dá)PER1的細(xì)胞系進行PER1過表達(dá)處理，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PER1的肝癌細(xì)胞接受輻照后克隆形成率明顯降低，凋亡明顯升高。射線所發(fā)揮殺傷細(xì)胞的作用，主要依賴其造成的DNA損傷，當(dāng)DNA損傷發(fā)生時，細(xì)胞周期明顯延遲，同時啟動細(xì)胞凋亡進程[24]。作為重要的時鐘基因，PER1不僅維持生物節(jié)律還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因p53，c-myc等的表達(dá)來穩(wěn)定細(xì)胞周期[25]。Fu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Per基因缺陷小鼠接受X射線照射以后相對于野生型小鼠免疫細(xì)胞凋亡增加了兩倍，此外p53在Per基因缺陷小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平也明顯低于在野生型小鼠系內(nèi)的表達(dá)。并且p53在肺癌中的表達(dá)也明顯高于正常肺組織，說明了Per基因可以誘導(dǎo)p53的表達(dá)。這些結(jié)果與過表達(dá)Per基因的白血病細(xì)胞中的研究結(jié)果一致[27]。這些研究證明Per1基因可以通過上調(diào)p53水平來促進細(xì)胞的凋亡。本次研究也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PER1的肝癌細(xì)胞受到照射以后，其凋亡比例明顯升高，通過檢測凋亡相關(guān)信號通路蛋白發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PER1后的BEL-7402肝癌細(xì)胞接受X射線照射以后，抗凋亡蛋白Bcl-2明顯降低，而凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3斷裂明顯增多。結(jié)合本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PER1在肝癌細(xì)胞系輻射敏感性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，能夠明顯增強肝癌細(xì)胞的輻射敏感性。因此，此項研究為基于PER1的肝癌放療增敏提供了一定參考。