亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        PER1對人肝癌細(xì)胞BEL-7402輻射敏感性的影響

        2020-03-26 12:05:22潘書賢肖昌浩胡文濤
        激光生物學(xué)報 2020年1期
        關(guān)鍵詞:肝癌劑量生物

        潘書賢,肖昌浩,黃 皓,胡文濤

        (蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護學(xué)院, 放射醫(yī)學(xué)與輻射防護國家重點實驗室, 江蘇省高校放射醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心, 蘇州 215123)

        肝癌在全世界的致死性癌癥中排名第三,每年有將近750 000名新增病例[1]。在過去的幾十年間,肝癌潛在的流行病學(xué)危險因素一直在增加[2]。隨著肝癌的影像診斷,外科手術(shù)和肝移植等技術(shù)取得了巨大的進步,肝癌患者的生存率也出現(xiàn)大幅度的提高。然而,肝癌患者的預(yù)后情況卻仍然不理想[3]。大約有60%的肝癌病人需要接受放療,但是,肝癌卻被認(rèn)為是一種輻射抗性腫瘤,其放療效果并不理想,五年生存率只有3%~5%[4]。因此,找到調(diào)控肝癌輻射敏感型的目標(biāo)分子對于提高肝癌的輻射敏感性和改善放療效果是很有必要的。

        晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)蛋白(period circadian regulator 1, PER1)是調(diào)節(jié)生物節(jié)律的時鐘蛋白,作為生物節(jié)律負(fù)反饋調(diào)節(jié)原件參與生物節(jié)律的調(diào)節(jié),PER1蛋白主要集中在細(xì)胞質(zhì)中與另一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白隱花色素受體(cryptochrome,CRY)結(jié)合形成復(fù)合體,形成的復(fù)合體進一步被PER蛋白激酶CK1酶磷酸化,然后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核與CLOCK:BMAL1結(jié)合來抑制其功能,從而對生物節(jié)律產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)[5-7]。除此之外,Per1基因編碼的蛋白還是生物節(jié)律調(diào)節(jié)的重要限制原件,能夠重置生物節(jié)律時相[8,9]。PER1蛋白的表達(dá)水平隨著生物節(jié)律的波動而變化,而且PER1自身節(jié)律的變化在生物節(jié)律功能的發(fā)揮構(gòu)成中也是必要的[10]。Niu等[11]研究發(fā)現(xiàn),高水平表達(dá)PER1的膠質(zhì)瘤組織對X射線的敏感性較高,并且在高水平表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,X射線引起的凋亡明顯增多,此外,研究還發(fā)現(xiàn),X射線能夠促進PER1的表達(dá),但是在正常組織中并未觀察到類似現(xiàn)象。這提示PER1與腫瘤組織的輻射敏感性有關(guān),然而,其與肝癌細(xì)胞輻射敏感性的關(guān)系還未曾報道,并且PER1參與調(diào)節(jié)腫瘤輻射敏感性的具體機制尚不明確。

        在本次研究中,我們通過檢測PER1蛋白以及其mRNA在輻射敏感性不同的肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平,同時也通過試驗驗證PER1蛋白在肝癌細(xì)胞輻射敏感性中的作用,對PER1增強肝癌細(xì)胞輻射敏感性的潛在機制進行了初步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PER1能夠增強肝癌細(xì)胞的輻射敏感性。本次研究也為進一步提高肝癌的放療效果提供了試驗基礎(chǔ)。

        qRT-PCR用來檢測RA患者滑膜組織P2X7受體和MH7A細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6相對表達(dá)水平。實驗步驟如下:收集處理好滑膜組織或MH7A細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄后,用SYBER green試劑盒進行實時熒光PCR實驗。PCR條件為:96℃ 30 s,1個循環(huán);PCR反應(yīng),96 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,45個循環(huán);溶解,96 ℃ 15 s,65℃ 20s,96 ℃15s,1個循環(huán)。PCR結(jié)束后,根據(jù)相應(yīng)的公式,以標(biāo)準(zhǔn)曲線進行校正,計算出mRNA的相對表達(dá)。

        貴州骨干水源工程建設(shè)任重道遠(yuǎn),肩負(fù)著解決全省工程性缺水問題的重任。國發(fā)〔2012〕2號文件明確提出:在安排中央財政轉(zhuǎn)移支付和中央預(yù)算內(nèi)投資時,加大對貴州水利建設(shè)投入力度,支持貴州如期完成“三位一體”綜合規(guī)劃提出的水利建設(shè)目標(biāo)。因此,在國家財政和地方財政提供基礎(chǔ)保障的前提下,充分利用好各項優(yōu)惠政策,以省級水利融資平臺為主,短期內(nèi)主要依靠金融機構(gòu)貸款,中遠(yuǎn)期采取金融機構(gòu)貸款、上市融資、發(fā)行企業(yè)債券等方式融資,可以建立起貴州省骨干水源工程建設(shè)投入穩(wěn)定增長機制。

        用雙尾t檢驗分析兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計學(xué)差異,用SPSS9.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析。不同組間比較方差齊性,相同指標(biāo)兩處理組或者多處理組間比較經(jīng)正態(tài)性檢驗后符合正態(tài)分布再用t檢驗,P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板,于對數(shù)生長期根據(jù)試驗說明書進行PER1過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染,每孔載體用量為5 000 ng,Lipo3000脂質(zhì)體用量為3.75 μL。轉(zhuǎn)染后過5 h吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,并更換無轉(zhuǎn)染試劑的正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

        1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

        人肝癌細(xì)胞SMMC-7721,BEL-7402和HepG2為本實驗室保存細(xì)胞。胎牛血清,青霉素-鏈霉素抗生素混合液,DMEM高糖培養(yǎng)基和RPM1640培養(yǎng)基均購買自美國GIBCO公司。Trypsin-EDTA,BCA蛋白定量試劑盒購買自Bio SHARP生物科技公司。PER1蛋白抗體(鼠抗)購買自美國CST公司。細(xì)胞凋亡試劑盒、p53、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠和一抗稀釋液購買自上海碧云天生物技術(shù)公司。PER1過表達(dá)載體(pcDNA3.1-PER1)由上海生工設(shè)計并構(gòu)建。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買自Takara公司,定量PCR試劑盒購買自康潤生物。SMMC-7721,HepG2用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,BEL-7402用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,均培養(yǎng)于5%CO2,37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。X射線照射采用美國RAD SOURCE RS-2000X射線儀,劑量率為1.2 Gy/min,細(xì)胞照射劑量為0、2、4、6、8、10 Gy,細(xì)胞均培養(yǎng)于直徑60 mm的平板培養(yǎng)皿中進行照射。

        克隆形成試驗用來檢測過表達(dá)PER1的BEL-7402細(xì)胞系接受X射線照射后的存活情況。具體方法為接種100、200、400、800、2 000、5 000個細(xì)胞于直徑60 mm培養(yǎng)皿中,分別對應(yīng)X射線劑量為0、2、4、6、8、10 Gy,然后于5%CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d,接著吸去培養(yǎng)基,用70%乙醇固定后結(jié)晶紫染色,計數(shù)克隆。試驗重復(fù)3次??寺⌒纬陕?克隆集落數(shù)量/接種細(xì)胞數(shù)量×100%。存活曲線利用Graphpad軟件繪制。

        (3)某工業(yè)廢水中含有少量的As2O3,向該廢水中通入硫化氫可將其轉(zhuǎn)化為更難溶的As2S3,該反應(yīng)的化學(xué)方程式為____。

        1.3 蛋白免疫印跡

        TRIzol試劑裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,PER1的mRNA表達(dá)通過GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化,試驗重復(fù)3次。

        1.4 實時熒光定量PCR

        RIPA裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白,用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量,聚丙烯酰胺凝膠中添加蛋白為50 μg,以蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為參照,確定目的蛋白的位置,電泳起始電壓為80 V,待樣品到達(dá)分離膠后提高電壓至120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑將要跑到凝膠底部時,停止電泳。然后在200 mA,90 min條件下將凝膠中的蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。接下來用PBST配置的5%牛奶封閉1 h,加入PER1一抗4 ℃過夜。PBST洗膜8遍,每遍5 min,加入對應(yīng)二抗,室溫孵育1 h,用PBST洗膜8次,每次5 min,用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影,拍照。最后用Image J軟件進行灰度值定量分析。試驗重復(fù)3次。

        1.5 細(xì)胞凋亡分析

        如圖1所示,在照射劑量為0、2、4、6、8、10 Gy情況下,SMMC-7721、BEL-7402和HepG2細(xì)胞的存活率都隨著劑量的增加出現(xiàn)降低的趨勢。其中SMMC-7721在三種細(xì)胞系中對輻射最敏感,BEL-7402的輻射抗性在三種肝癌細(xì)胞系中最高(BEL-7402與HepG2相比P<0.01;與SMMC-7721相比P<0.001)。

        1.6 克隆形成試驗以及存活曲線的繪制

        四只表演虎間隔2米,成東西方向一字排開,臥于表演場地北側(cè)中央,頭南尾北,所有表演者立于虎后,擊鼓人員位于東北方向。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

        孩子不在身邊,所幸老人還有個學(xué)生,跟進跟出地伺候他。許多人都說:“看這年輕人,放著自己的正事不干,成天陪著老頭子,好像很孝順的樣子。誰不知道,他是為了老頭子的錢。”

        2 結(jié)果與分析

        2.1 細(xì)胞存活曲線

        消化對數(shù)生長期的BEL-7402肝癌細(xì)胞,接種于6孔板,每孔接種細(xì)胞數(shù)為3×105個,轉(zhuǎn)染PER1過表達(dá)載體,5 h后換液,24 h后用5 Gy X射線照射,照射后24 h檢測細(xì)胞凋亡情況。

        圖1 SMMC-7721,HepG2,BEL-7402三種肝癌細(xì)胞系在不同劑量下的存活曲線Fig.1 Survival curves of SMMC-7721, HepG2, BEL-7402 cells exposed to X-ray irradiation of gradient doses*:P<0.05;** :P<0.01;*** :P<0.001*:P<0.05,** :P<0.01,*** :P<0.001

        2.2 蛋白免疫印跡試驗和實時熒光定量PCR試驗

        經(jīng)過照射后發(fā)現(xiàn)BEL-7402對射線的抗性明顯強于SMMC-7721和HepG2。三種細(xì)胞系中SMMC-7721的輻射敏感性最強,我們選用BEL-7402和SMMC-7721兩種細(xì)胞檢測PER1蛋白的表達(dá)。蛋白免疫印跡結(jié)果示于圖2。由圖2可見,BEL-7402中PER1蛋白表達(dá)水平明顯低于SMMC-7721細(xì)胞中的PER1表達(dá)(圖2a、2b,P<0.01)。類似的結(jié)果也在定量PCR結(jié)果中得到驗證,如圖2c所示,P<0.05。

        圖2 PER1在SMMC-7721,HepG2,BEL-7402三種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.2 The expression of PER1 in SMMC-7721, HepG2, BEL-7402 cells(a,b)PER1蛋白在三種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及灰度值檢測;(c)PER1 mRNA 在三種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)。*:P<0.05,** :P<0.01(a,b)Expression of PER1 protein in the 3 hepatoma carcinoma cell lines;(c)Expression of PER1 mRNA in the 3 hepatocellular cell lines.*:P<0.05,** :P<0.01

        2.3 過表達(dá)PER1蛋白后的細(xì)胞存活曲線

        PER1在BEL-7402和SMMC-7721的表達(dá)結(jié)果顯示,在輻射抗性更高的BEL-7402細(xì)胞系中PER1表達(dá)水平很低,因此我們選用BEL-7402細(xì)胞系研究PER1的輻射增敏作用,結(jié)果如圖3所示,過表達(dá)PER1后,BEL-7402細(xì)胞系中PER1蛋白表達(dá)明顯升高,RT-qPCR試驗也得到了同樣的結(jié)果(圖3中a~c,P<0.001)。過表達(dá)PER1的BEL-7402細(xì)胞接受0、2、4、6、8、10 Gy梯度劑量照射處理后,細(xì)胞克隆存活率明顯低于未接受PER1過表達(dá)處理的對照組(圖3d,P<0.001)。

        2.4 細(xì)胞凋亡檢測

        根據(jù)圖2試驗結(jié)果,發(fā)現(xiàn)PER1在BEL-7402中的表達(dá)明顯低于SMMC-7721和HepG2,為了觀察PER1在肝癌細(xì)胞系輻射敏感性中的作用,接下來對BEL-7402進行過表達(dá)PER1處理,并檢測PER1對X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果如圖4a和4b所示,接受X射線照射以后,過表達(dá)PER1的BEL-7402細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.01)。

        圖3 BEL-7402過表達(dá)PER1后不同輻照劑量下的存活曲線PER1Fig.3 Survival curves of BEL-7402 cells overexpressing PER1 after irradiation(a~c) BEL-7402過表達(dá)PER1后其蛋白及mRNA在細(xì)胞中的表達(dá);(d) 過表達(dá)PER1后BEL-7402肝癌細(xì)胞在不同劑量X射線照射下的存活分?jǐn)?shù)。PER1-OE:過表達(dá)PER1的BEL-7402肝癌細(xì)胞系;Control:未經(jīng)過表達(dá)處理的BEL-7402肝癌細(xì)胞系。*** :P<0.001 (a~c)Verification of PER1 overexpression in BEL-7402 cells by western blot and RT-qPCR;(d)Survival fraction of BEL-7402 cells under different doses of X-rays after overexpression of PER1. PER1-OE:BEL-7402 cells overexpressing PER1;Control:BEL-7402 cells untreated with overexpression. *** :P<0.001

        2.5 免疫印跡試驗

        為了研究PER1在增強X射線誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡中的機制,接下來對過表達(dá)PER1的BEL-7402細(xì)胞進行X射線照射處理。根據(jù)圖1結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報道,選取5 Gy的劑量進行照射,照射后24 h檢測細(xì)胞水平抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3以及p53的表達(dá)水平。結(jié)果表明,過表達(dá)PER1后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低,而凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3斷裂增多,同時p53表達(dá)明顯升高(圖5中a~d,P<0.01)。

        圖4 BEL-7402過表達(dá)PER1后細(xì)胞凋亡的檢測Fig.4 Apoptosis rate of BEL-7402 cells overexpressing PER1 after irradiation(a)凋亡流式檢測結(jié)果;(b)凋亡率統(tǒng)計。PER1-OE:過表達(dá)PER1的BEL-7402肝癌細(xì)胞系;Control:未經(jīng)過表達(dá)處理的BEL-7402肝癌細(xì)胞系。** :P<0.01(a)Representative images of cytometry analysis;(b)Statistical results of apoptosis rates.PER1-OE:BEL-7402 cells overexpressing PER1;Control:BEL-7402 cells untreated with overexpression. ** :P<0.01

        圖5 過表達(dá)PER1的BEL-7402接受X射線照射后24 h凋亡相關(guān)蛋白檢測Fig.5 Detection of apoptosis related proteins in BEL-7402 cells overexpressing PER1 after irradiation(a)Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá);(b~d) 蛋白灰度值定量分析。PER1-OE:過表達(dá)PER1的BEL-7402肝癌細(xì)胞系;Control:未經(jīng)過表達(dá)處理的BEL-7402肝癌細(xì)胞系。*** :P<0.001 (a)Expression of Bcl-2 and cleaved caspase3 proteins;(b~d):Quantitative analysis of protein gray values. PER1-OE:BEL-7402cells overexpressing PER1;Control:BEL-7402 cells untreated with overexpression. *** :P<0.001

        3 討論

        肝癌的有效治療手段包括經(jīng)皮注射無水乙醇治療、高頻消融、外科手術(shù)切除等方法。非外科治療手段,例如動脈栓塞療法,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床中外科手術(shù)不能切除的肝癌[12]。放療作為肝癌非外科治療手段之一,雖然效果有待改善,但是能夠有效地幫助病人取得較好的臨床緩解[13]。在肝癌臨床放療中通過限制照射劑量來減少射線對正常肝臟的損害,這是由正常肝臟細(xì)胞對射線的低耐受性以及肝癌細(xì)胞自身的抗性所決定的。然而,隨著劑量的減少,肝癌細(xì)胞的殺傷作用也隨之減弱[14]。時鐘蛋白已經(jīng)被證明在多種腫瘤中異常表達(dá)[15,16]。PER1作為時鐘蛋白的一種,其功能主要是調(diào)節(jié)大腦和外周組織的多種生物進程。PER1通過與CRY形成復(fù)合體,參與到生物節(jié)律的調(diào)節(jié)中,二者形成的復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi),可被磷酸化酶降解。除此之外,PER1與CRY形成的符合體與CLOCK:BMAL1復(fù)合體相互作用,從而抑制CLOCK:BMAL1復(fù)合體的功能來延長生物節(jié)律周期,從而影響生物節(jié)律功能[7,17-19]。研究表明過表達(dá)PER蛋白家族會使小鼠更容易發(fā)生腫瘤,并且對射線敏感[20],而低氧造成的PER蛋白的降低,會增加細(xì)胞自身上皮轉(zhuǎn)化的功能[21]。另有研究證明PER1的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系[22],有試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),PER1和PER2作為時鐘基因的調(diào)節(jié)原件,在正常的人大腦和膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平都具有節(jié)律性,但是在兩種組織中,生物鐘的變化情況也是不同的。具體表現(xiàn)就是在膠質(zhì)瘤中生物周期為12 h,但是在正常人腦中的生物周期為24 h[23]。在本次研究中,對PER1在輻射抗性不同的三種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平進行了檢測,發(fā)現(xiàn)輻射抗性越高PER1的表達(dá)水平越低。然后對低表達(dá)PER1的細(xì)胞系進行PER1過表達(dá)處理,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PER1的肝癌細(xì)胞接受輻照后克隆形成率明顯降低,凋亡明顯升高。射線所發(fā)揮殺傷細(xì)胞的作用,主要依賴其造成的DNA損傷,當(dāng)DNA損傷發(fā)生時,細(xì)胞周期明顯延遲,同時啟動細(xì)胞凋亡進程[24]。作為重要的時鐘基因,PER1不僅維持生物節(jié)律還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因p53,c-myc等的表達(dá)來穩(wěn)定細(xì)胞周期[25]。Fu等[26]研究發(fā)現(xiàn),Per基因缺陷小鼠接受X射線照射以后相對于野生型小鼠免疫細(xì)胞凋亡增加了兩倍,此外p53在Per基因缺陷小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平也明顯低于在野生型小鼠系內(nèi)的表達(dá)。并且p53在肺癌中的表達(dá)也明顯高于正常肺組織,說明了Per基因可以誘導(dǎo)p53的表達(dá)。這些結(jié)果與過表達(dá)Per基因的白血病細(xì)胞中的研究結(jié)果一致[27]。這些研究證明Per1基因可以通過上調(diào)p53水平來促進細(xì)胞的凋亡。本次研究也發(fā)現(xiàn),過表達(dá)PER1的肝癌細(xì)胞受到照射以后,其凋亡比例明顯升高,通過檢測凋亡相關(guān)信號通路蛋白發(fā)現(xiàn),過表達(dá)PER1后的BEL-7402肝癌細(xì)胞接受X射線照射以后,抗凋亡蛋白Bcl-2明顯降低,而凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3斷裂明顯增多。結(jié)合本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PER1在肝癌細(xì)胞系輻射敏感性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用,能夠明顯增強肝癌細(xì)胞的輻射敏感性。因此,此項研究為基于PER1的肝癌放療增敏提供了一定參考。

        猜你喜歡
        肝癌劑量生物
        結(jié)合劑量,談輻射
        ·更正·
        全科護理(2022年10期)2022-12-26 21:19:15
        生物多樣性
        生物多樣性
        上上生物
        90Sr-90Y敷貼治療的EBT3膠片劑量驗證方法
        第12話 完美生物
        航空世界(2020年10期)2020-01-19 14:36:20
        LCMT1在肝癌中的表達(dá)和預(yù)后的意義
        microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展及診治中的作用
        Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
        国精产品推荐视频| 美腿丝袜视频在线观看| 亚洲精品成人无百码中文毛片| 久久久www成人免费毛片| 国产精品视频一区二区三区四| 国产丝袜免费精品一区二区| 亚洲精品一区二区三区新线路| 午夜爽爽爽男女免费观看影院 | 亚洲av本道一本二本三区| 久久久亚洲女精品aa| 午夜精品免费视频一区二区三区| 欧美猛少妇色xxxxx猛交| 欧美日本日韩aⅴ在线视频| 日本熟妇精品一区二区三区| 一区二区在线观看视频亚洲| 51国产偷自视频区视频| 国产97在线 | 免费| 亚洲ⅤA中文字幕无码| 国产自拍一区二区三区| 国产免费又爽又色又粗视频| 播放灌醉水嫩大学生国内精品| 中国女人a毛片免费全部播放| 五月开心六月开心婷婷网| 国产精品无码无在线观看| 亚洲人成综合网站在线| 国内精品久久人妻性色av| 免费日本一区二区三区视频| 人妻献身系列第54部| 最新欧美一级视频| 日本午夜艺术一区二区| 大尺度无遮挡激烈床震网站| 真人直播 免费视频| 丰满熟妇人妻av无码区| 亚洲国产精品悠悠久久琪琪| 国产成人av一区二区三区 | 亚洲不卡免费观看av一区二区| 熟女少妇内射日韩亚洲| 亚洲综合久久久| 亚洲精品av一区二区日韩| 无码 人妻 在线 视频| 青青青国产精品一区二区|