吳 瓊，林慧晶，徐兩蒲，孫 艷，林 多，陳冠楠*

(1.醫(yī)學光電科學與技術教育部重點實驗室， 福建省光子技術重點實驗室，福建師范大學光電與信息工程學院， 福州350007； 2.福建省婦幼保健院， 福州 350001)

DNA作為遺傳物質(zhì)的載體，攜帶了豐富的人體信息，是一種非常重要的生物分子。大量研究發(fā)現(xiàn)，DNA在疾病診斷治療、刑偵學及法醫(yī)學等領域都扮演了十分重要的角色[1-4]。醫(yī)生通過DNA的檢測，可獲取大量的人體健康狀況信息，為臨床診斷(特別是癌癥診斷)的治療方案確定及預后等，提供有效的判斷依據(jù)。目前，DNA檢測方法主要包括聚合酶鏈反應和微陣列技術，但此類方法通常需要熒光標記、存在成本較高、程序和檢測流程復雜、DNA分子內(nèi)在信息極易丟失、樣品無法重復利用等缺點[5]。

1928年，印度科學家Raman等[6]發(fā)現(xiàn)拉曼散射效應，證明該現(xiàn)象產(chǎn)生的頻率變化，均取決于散射物體自身的特性，可以產(chǎn)生具有“指紋”特性的拉曼光譜。在此基礎上，拉曼光譜技術已經(jīng)能夠獲得許多生物大分子的結構信息，例如：脂肪、DNA、蛋白質(zhì)、核糖、脫氧核糖、各種碳水化合物、染色體病毒等[7]。拉曼光譜以其精細的分辨能力、所需樣品量少等優(yōu)點，在醫(yī)學領域得到迅速的發(fā)展，國內(nèi)外學者更是將該技術運用于檢測人體各個部位[8-17]。但是，拉曼光譜技術仍存在一些無法克服的短板。由于拉曼散射的截面僅有10-30～10-25cm-1，造成了極弱拉曼散射信號和極高生物分子的熒光信號。因此，拉曼光信號常常淹沒在噪聲中，使得拉曼光譜技術在生物醫(yī)學領域的發(fā)展大大受限[18]。直到1974年，F(xiàn)leischman等[19]在電化學試驗中發(fā)現(xiàn)了表面增強拉曼散射現(xiàn)象，拉曼信號得到了大大的增強，這種局面才有了轉機。

表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman scattering,SERS)是指分子吸附在具有納米級粗糙度的金屬表面，拉曼散射信號可以得到極大增強的現(xiàn)象。SERS增強機理主要來自[20-21]：1)電磁場增強包括表面等離激元共振、尖端避雷針效應、鏡像場增強；2)化學增強主要包括金屬-分子間電荷轉移、表面絡合物表面活性位。研究表明，電磁場增強的貢獻遠大于化學增強，而電磁場增強主要來自于表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)，即金屬中的自由電子在光電場下集體發(fā)生了振蕩效應。SERS的出現(xiàn)，克服了常規(guī)拉曼的固有缺陷，極大拓展了拉曼光譜的應用。近40年來，科學家進一步研究表明吸附在或者非常接近特定粗糙金屬(例如：金、銀、銅)表面的待測物質(zhì)的拉曼信號會被大大提高(約為1013～1015倍)，并且能夠抑制熒光的產(chǎn)生，使表面拉曼增強光譜技術成為一種十分有潛力的檢測方式[22-24]。

隨著光學檢測技術的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)SERS技術有希望克服當前DNA檢測存在的缺陷[1]。因此，研究人員致力將表面增強拉曼光譜技術應用于DNA檢測，力求發(fā)展一種快速、無損、簡便、檢測限度低的檢測方法。目前，DNA-SERS檢測主要有兩種方式，一種方法是使用標簽分子修飾DNA，來實現(xiàn)檢測目標DNA的目的。另一種是無需加入標記分子，進行非標記的DNA快速檢測。本文主要介紹了非標記DNA-SERS檢測技術的發(fā)展進程及本課題組的初步研究進展。

1 標記DNA-SERS檢測

標記法是將目標分子通過吸附、雜交等作用，與有一定強度且易分辨的拉曼標記物相連，后通過檢測拉曼標記分子，間接達到檢測目標分子的目的。SERS標記分子能夠產(chǎn)生強烈的SERS信號，并易于修飾生物分子的一些物質(zhì)。這種標記物常以金或銀納米顆粒為增強基底，同時利用可產(chǎn)生SERS信號的染料分子在納米粒子表面修飾。2009年，MacAskill等[25]已經(jīng)證明了一種新的SERS檢測方法，該方法是將與目標DNA結合力更強、且用染料標記的探針與目標DNA雜交后，致使探針SERS信號降低，以此證明待測物中有目標DNA的存在。與未修飾的標記DNA探針相比，該方法實現(xiàn)了精確匹配和錯配間的更大區(qū)分。Mhairi等[26]將TaqMan檢測技術與SERS技術相結合，形成一種全新的DNA檢測方式。并且，為了證明該檢測方式可用于臨床，該研究小組利用這項技術檢測基因組MRSA株內(nèi)的mecA基因，并將金黃色葡萄球菌株作為對照試驗。試驗證明，這種新的檢測方法可用于生物檢測。同時，該小組通過銀納米顆粒靜電相互作用的差異，證明了幾種標記DNA染料親和力的差異。結果表明，單鏈DNA、雙鏈DNA和游離染料標簽的SERS強度存在明顯差異，并證明表面引力是由于核苷酸的靜電電荷引起，而非來自SERS染料的親和力。該試驗進一步證明，通過對試驗條件和序列組成的優(yōu)化，可以在較低的DNA濃度下實現(xiàn)高精度的DNA序列檢測[27]。2014年，Tara[28]研究小組首次報道了功能化銀納米粒子和鍍銀磁性納米粒子組合成“三明治”模型，并在穩(wěn)定夾層中進行DNA檢測，能同時識別多種目標分子。這種方法將目標識別與磁性捕獲相結合，實現(xiàn)了樣品低濃度檢測，有極高的靈敏度。2017年Su[29]小組研究出了多色金銀納米蘑菇，是一種即用型SERS探針，可用于超敏感和多路DNA/miRNA檢測。其特點是制備過程簡便，易于合成，無需進一步的生物功能化，為實現(xiàn)多指標同時檢測的生化診斷和細胞成像創(chuàng)造了極大的可能。2018年，Pala等[30]介紹了12種用于SERS-DNA檢測的新型寡核苷酸功能化納米粒子，研究表明12種染料可以獨立表達出特異信號，為實現(xiàn)多重復路檢測奠定了基礎。

近年來，有許多研究學者將PCR(polymerase chain reaction)擴增技術與DNA檢測技術結合，研發(fā)出了新的檢測方法。在2016年，Eugene等[31]對循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)進行研究，他們利用了標準PCR的靈敏度優(yōu)勢與SERS技術的多路復用特點，檢測出重要的黑色素瘤突變，并采用該方式測定了血清樣品中的基因型細胞系和ctDNA，證實了此法的可行性。2018年，李小舟[32]小組將含有目標突變基因的DNA進行擴增，用熒光標簽標記互補序列上的DNA鏈，再運用SERS技術進行檢測分析，獲得了結直腸癌患者的基因突變率，并與臨床檢測所得的結果一致。

2 非標記DNA-SERS檢測

2.1 國內(nèi)外研究進展

為了獲取表面增強拉曼光譜，必須要使分析物靠近或吸附在貴金屬表面。使用非標記SERS技術檢測，常需挑選一個適當?shù)脑鰪娀?，獲得DNA堿基的SERS信號[33]。其優(yōu)勢在于：不需要引入外源性的拉曼標記物,不會對待測DNA的原生信號產(chǎn)生干擾。

早在2006年，Bell和Narayana[33]已經(jīng)嘗試利用表面增強拉曼技術對低濃度無標記單核苷酸進行檢測，獲取DNA分子與不同銀膠作用后的光譜，并對結果進行統(tǒng)計分析。2008年，Aoune等[1]報道了如何成功獲得高質(zhì)量的單鏈和雙鏈DNA-SERS光譜。這種方法是將納米金殼SERS基底與DNA結合，使重現(xiàn)性得到了顯著的提高。這是單鏈DNA的熱解和雙鏈DNA雜交所帶來的高規(guī)律性和高控制性的電磁增強。而后，該小組又提出了一種基于表面增強拉曼光譜的簡單、無標記的DNA雜交檢測方法[34]。試驗證明，將探針DNA序列中的腺嘌呤換成人工合成的2-AP堿基，仍然可以檢測到腺嘌呤互補堿基的SERS信號，實現(xiàn)定量檢測含有腺嘌呤的目標DNA。2011年，Papadopoulou和Bell[35]，通過硫醇連接DNA序列和金納米顆粒表面，此時DNA站立在納米顆粒表面，使得腺嘌呤的SERS信號得到優(yōu)先增強。之后，利用堿基的非特異性結合使DNA重新定位，可降低這種效應。這種重定向?qū)е聫姸雀淖兊默F(xiàn)象，被用于分子信標雜交的無標記檢測。研究表明，利用DNA堿基中的固有信號，進行無標記SERS檢測，在生物診斷中具有巨大的潛在應用價值。2015年，Marks等[36]設計了一個利用功能性納米粒子檢測小型血液生物標記物的SERS檢測平臺。試驗中適當調(diào)整納米探針的參數(shù)，則能實現(xiàn)靈敏度、范圍、重現(xiàn)性、顆粒穩(wěn)定性以及與生物識別分析的整體控制?？偟膩碚f，這是一種可控的SERS分析平臺，用適配體連接SERS活性納米粒子，組裝檢測小的毒素分子。同年，Sun等[37]構建了一種新型的納米通道傳感平臺，該裝置簡單易行，可在受限的三維納米空間實現(xiàn)無標記、超靈敏、高特異性的DNA檢測。Xu等[4]利用碘化鉀修飾Ag納米基底，并在接近人體生理條件的環(huán)境中，獲取了單鏈和雙鏈核苷酸的高重現(xiàn)性的SERS信號。值得注意的是，碘化層不僅能夠清除Ag納米粒子表面的雜質(zhì)，還能防止Ag納米粒子表面與DNA直接發(fā)生相互作用，確保獲得高重現(xiàn)性的信號。并且，該工作證明MgSO4能使帶負電荷的DNA更有效地吸附，能夠使Ag IMNPs產(chǎn)生聚集，產(chǎn)生較強的SERS信號。他們認為可以將磷酸骨架作為內(nèi)部標記，從而使得寡核苷酸的SERS光譜標準化，以除去外部因素對光譜的影響。2018年，Han小組[38]將表面增強拉曼光譜技術與微流控技術結合，研發(fā)了一種基于銀納米顆粒(AgNPs)和氧化石墨烯(GO)簡便的激光刻劃的生物芯片，該芯片可重復用于DNA檢測。AgNPs@GO復合膜的可編程激光刻劃芯片，通過將復合材料剝離成分層多孔結構，使由石墨烯支撐的AgNPs組成的靈敏SERS通道直接形成所需圖案。DNA和石墨烯之間的非共價相互作用介導了DNA序列可控的捕獲和釋放，由此，在該生物芯片上可重復進行SERS檢測，有望對遺傳疾病診斷提供幫助。2019年，Li等[39]開發(fā)了一種新的非標記DNA檢測方法，可實現(xiàn)定量檢測單鏈DNA。他們引入一種新的界面劑二氯甲烷，并將其作為內(nèi)標分子，實現(xiàn)了對不同鏈長單鏈DNA的高靈敏檢測，并且突破了雙鏈DNA的檢測局限。此外，該方法已被證明能夠識別具有單堿基變化的長鏈DNA中的基因突變，在快速遺傳分析方面具有很大的臨床診斷潛力。

2.2 本課題組研究進展

福建師范大學項目組將DNA-SERS檢測用于鼻咽癌的早期診斷，并對采集的數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，早期鼻咽癌、晚期鼻咽癌、正常鼻咽組織DNA的診斷準確率分別為87.9%，86.8%和92.3%。該項探索性研究證明了可將SERS測試利用于組織中提取的DNA，此方法有潛力成為鼻咽癌早期篩查的一種新的方式[40]。本課題組的劉秀杰等[41]發(fā)明了一種DNA鏈作為信號開關檢測重金屬離子的方法：利用銀鏡反應制作的玻片作為表面增強拉曼散射(SERS)檢測的基底，再通過硫醇鍵將用Cy5標記的DNA鏈連接在還原有銀膜的基底上，用DNA鏈作為拉曼信號的開關，以此來間接表明待測介質(zhì)中是否存在重金屬離子汞(Hg2+)。通過鍍銀的玻片做為重金屬檢測的基底，使得SERS增強效果和檢測的靈敏度得到了大大的提升，并且具有極好的重復性。林多等[42]利用金屬羰基化合物的光譜特性，設計了一種基于表面增強拉曼光譜技術的比率檢測試驗對鼻咽癌患者血液中游離態(tài)的EB病毒DNA進行檢測。試驗中主要利用錸羰基化合物(Re-CO)作為DNA探針，另外一種鋨羰基化合物(Os-CO)則被鑲嵌于SERS基底中作為DNA檢測內(nèi)標，最后在基底表面修飾上鏈霉親和素，用來捕獲帶有生物素的游離態(tài)目標DNA。由于這兩種羰基化合物的拉曼信號都處于生物分子的指紋區(qū)外(靜默區(qū))，不會受其他生物分子影響，因此該文章提出的方法有望對血液中的游離DNA進行準確的定量檢測。之后，他們利用光譜信號處于1 800～2 200 cm-1的羰基化合物(Os-SCO和Re-SCO)作為SERS探針，實現(xiàn)低濃度DNA檢測。此外，還將SERS探針(Re-SCO)裝備在包裹有介孔硅的納米棒材料中，在光的刺激下可將該探針大量釋放到SERS基底上獲得其拉曼信號，由此實現(xiàn)SERS信號的二次放大。研究表明，利用該技術能對DNA實現(xiàn)可靠以及超靈敏的檢測，這對于發(fā)展基于SERS的液體活檢技術具有重要意義[43]。

基于以上的文獻探索，本課題組也對單鏈DNA檢測展開了試驗研究，試驗流程如圖1所示。

圖1 單鏈DNA檢測流程圖Fig.1 Schematic forsingle-strand DNA detection

圖2 SERS光譜圖Fig.2 SERS spectra(a)純銀膠的拉曼背景信號；(b)單鏈DNA的SERS光譜(a)The background signal of pure silver colloid;(b)SERS spectrum of single-strand DNA

表1 DNA表面增強拉曼光譜峰位歸屬[1,4,31-33,38]Tab.1 The peak positions and tentative assignment of major vibrational bands in DNA

Raman bands(cm-1)Assignmentsa683G735A, ring breathing792C, T, PO2-, skeleton stretching1 092PO2-, symmetric stretching1 222 A, C, or T, ring stretching1 326A1 459CH2, deformation1 555A, G1 629T, C

本試驗獲得了單鏈DNA的表面增強拉曼光譜，圖2中b曲線為單鏈DNA的SERS光譜，圖2中a曲線為銀膠的背景信號。值得注意的是，在單鏈DNA的SERS光譜圖中可以觀察到683、735、792、1 092、1 222、1 326、1 459、1 555以及1 629 cm-1拉曼譜峰(圖2中b曲線)。如表1所示，有很多試驗證明這些譜峰可以歸屬于磷酸骨架(PO2-)、腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶[1,4,33-35,40]。在今后的研究里，我們希望可以利用SERS技術對DNA分子中的生化成分組成及數(shù)量差異進行進一步的探索。

3 總結與展望

本文簡單介紹了國內(nèi)外研究者對DNA檢測的研究，特別是非標記DNA檢測。SERS的主要優(yōu)點：一是能夠用最少生物樣品進行檢測，其靈敏度甚至可以達到10-15mol/L；二是利用SERS技術可以實現(xiàn)多重復路檢測，同時對多個目標物進行分析，有利于疾病的診斷和預后。SERS技術的優(yōu)勢恰恰克服了當下臨床診斷方法的一些不足，目前，該技術已被應用于真實的臨床樣本。大量的科研人員致力于發(fā)展一種簡單、快速的DNA檢測技術，希望能夠通過SERS技術獲得DNA中的堿基排列順序、堿基突變序列等，從而探索更豐富、更深層的遺傳信息。

綜上所述，SERS技術在DNA檢測方面表現(xiàn)出了巨大的應用潛力。雖然，在目前的技術水平和試驗條件下，SERS光譜無法確切表達出DNA序列中堿基的特定順序，但采用標記的SERS檢測技術，已經(jīng)實現(xiàn)了對DNA高靈敏度、高特異性的定性甚至定量檢測。而非標記DNA-SERS檢測技術，也以其簡便、快捷、無損等優(yōu)勢，成為時下的研究熱點，有很大的發(fā)展?jié)摿?。相信在不久的將來，非標記DNA-SERS檢測技術能夠發(fā)展為一種快速、準確的疾病基因診斷新方法。