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        枯草芽孢桿菌酶的還原性能及用于靛藍染料還原

        2020-03-26 06:15:32吳艷麗陳建芳
        關(guān)鍵詞:胞外酶緩沖溶液枯草

        廖 歡,吳艷麗,2,周 亭,陳建芳

        (1.湖南工程學(xué)院 材料與化工學(xué)院,湘潭 411100;2.德永佳紡織制衣有限公司,東莞 523000)

        靛藍染料作為一種還原染料,因牢度優(yōu)良,尤其是耐日曬和耐皂洗色牢度,被廣泛應(yīng)用在纖維素纖維上[1-3].但該類染料不溶于水,不利于后續(xù)染色,通常改進措施是將其分子共軛雙鍵系統(tǒng)中的羰基在堿性溶液中與保險粉(連二亞硫酸鈉)相互作用,羰基還原轉(zhuǎn)變成羥基,成為可溶于水的隱色體[4-6].同時,保險粉在反應(yīng)過程中,被氧化成硫酸鹽等一系列含硫物質(zhì),而這些含硫物質(zhì)不能回收再利用,只能隨著印染廢水排放到自然界中,降解后會產(chǎn)生H2S,污染大氣[7-8].目前,有研究還原染料間接電化學(xué)染色利用電化學(xué)還原代替保險粉的工藝,劉祥霞[9]等利用葡萄糖作為靛藍染料的還原劑,測定了葡萄糖在不同還原體系中分子結(jié)構(gòu)的變化,且優(yōu)化了還原及染色工藝.譚曉冬[10]使用超聲波對靛藍進行超聲電化學(xué)還原,并運用新型鐵-三乙醇胺-葡萄糖酸鈣(Fe-TEA-Ca)絡(luò)合體系作為媒介,以達到染色目的.以上研究均有特色,但是前者存在染色時間長,上染率偏低,而后者操作復(fù)雜且設(shè)備占地面積大等問題.

        針對以上問題,本文通過制備具有還原性的枯草芽孢桿菌酶,并測試其在靛藍染料體系中的還原能力,嘗試在電化學(xué)還原中使用更環(huán)保的生物酶-蒽醌還原體系,為后續(xù)生物酶運用于電化學(xué)還原染色研究提供基礎(chǔ).目前,暫未見關(guān)于生物酶運用到電化學(xué)還原靛藍染料的相關(guān)研究報道.

        1 實驗部分

        1.1 實驗材料與試劑

        枯草芽孢桿菌(生化試劑,鄭州華冠生物技術(shù)開發(fā)有限公司);蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉(均為生化試劑,北京普博欣生物試劑公司);靛藍(化學(xué)純,徐州開達精化有限公司);1,8-二羥基-9,10-蒽醌(1,8-DHAQ,分析純,西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司);Tris(三羥甲基氨基甲烷,色譜純,北京普博欣生物科技責(zé)任有限公司);氫氧化鈉、硫酸、氯化鈉、磷酸鈉(均為分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司).

        1.2 主要實驗儀器與設(shè)備

        LRH-150B生化培養(yǎng)箱、YX系列全溫振蕩器、TS-211B光照搖床、JY92-II超聲波細胞粉碎機、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌箱、722型分光光度計、TK-98022868型臺面式pH/ISE測試儀、COO2天津艾達恒晟電解池.

        1.3 培養(yǎng)基的配方與配制

        枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方如表1所示.

        表1 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方

        枯草芽孢桿菌的培養(yǎng):

        用1 L的三角錐形瓶按照以上處方配制500 ml的標準培養(yǎng)液,用紗布封口后在立式壓力蒸汽滅菌箱內(nèi)滅菌20 min.待滅菌完成后,溫度降至60 ℃時在單人單面凈化臺上接種枯草芽孢桿菌.接種完后將培養(yǎng)液放入轉(zhuǎn)速為160 rpm、溫度為37 ℃的水浴振蕩器中培養(yǎng)12 h,再將培養(yǎng)液取出,進行第一次離心.離心后將培養(yǎng)液和細胞分開,培養(yǎng)液可直接用于實驗,細胞則用pH為7的磷酸鈉鹽緩沖液溶解,用超聲波細胞粉碎機將細胞粉碎,再采用0.22 μm的濾紙和無油真空泵進行過濾,過濾后的酶液留作實驗[11-12].

        1.4 還原酶的定位

        枯草芽孢桿菌不僅分泌胞內(nèi)酶,還有胞外酶,實驗需要的是具有還原性的酶.通過將培養(yǎng)液和輔酶NADH結(jié)合,再與1,8-DHAQ作用,看溶液的導(dǎo)電性及還原能力是否符合靛藍還原染色的要求定位還原酶.電解液配制:各取5 mL枯草芽孢桿菌胞內(nèi)酶與胞外酶培養(yǎng)液分別加入1.8 mM/L的輔酶(NADH),用Tris-HCl緩沖溶液混合,將0.06 mM/L的1,8-DHAQ用Tris-HCl緩沖液溶解,將酶混合液與1,8-DHAQ溶液混合,再將混合后的溶液分別定容至100 mL.

        1.5 還原能力的測定1.5.1 電子傳遞能力測試

        閉合回路中的電流大小反映溶液的導(dǎo)電能力,因此實驗通過測試外電流的大小來表示溶液的導(dǎo)電能力.實驗在閉合回路中接入一個萬用表和電流表,將配制好的電解液放入電解池中,通過調(diào)節(jié)外加電壓來改變回路中的電子傳遞能力.將電源電壓調(diào)至1 V、3 V…15 V,記錄不同外電壓下的電流值,平行測試3次,取平均值.

        1.5.2 還原電位的測試

        用868型臺面式pH/ISE測試儀測試體系的還原電位.接通電路,將電源電壓分別調(diào)至1 V,3 V…15 V,測試電解液的還原電位.

        1.5.3 染料還原效果的測試

        測試完還原電位后,向電解液中加入1 g靛藍,每隔10 min各取三組1 ml的染液樣品,一共取6次(0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min),用容量瓶定容至50 ml,再用分光光度計測試其吸光度,平行測試3次,取平均值.

        2 結(jié)果與討論

        2.1 枯草芽孢桿菌酶的電子傳遞能力

        由于溶解酶體系的Tris-NaOH(pH=11)緩沖溶液本身有導(dǎo)電性,所以測試酶液的導(dǎo)電性之前必須測試Tris緩沖溶液的導(dǎo)電性.再向Tris-NaOH(pH=11)緩沖溶液中分別加入含胞外酶與胞內(nèi)酶的培養(yǎng)液,溫度為60 ℃,具體測試結(jié)果如表2所示.

        表2 Tris-NaOH(pH=11)緩沖溶液與含枯草

        由表2可知,Tris-NaOH緩沖溶液具有一定的導(dǎo)電能力,當(dāng)緩沖液中加入胞外酶后,電流基本保持不變,這說明胞外酶基本沒有傳遞電子能力.同時,含有胞內(nèi)酶的電解液隨著外加電壓的增大,電流也在增大,當(dāng)外加電壓達到15 V時,電流數(shù)值是胞外酶的131倍.說明胞內(nèi)酶電子傳遞能力遠高于胞外酶,因此只有胞內(nèi)酶才具有輸送電子能力.

        2.2 枯草芽孢桿菌酶的還原電位

        首先測試100 mL Tris-HCl緩沖溶液在不同的外壓下還原電位的變化情況,測試完Tris-HCl緩沖溶液的還原電位后分別向緩沖溶液中加入過量的胞內(nèi)酶液與胞外酶液,pH調(diào)節(jié)至11,溫度至60 ℃,測試不同外壓下還原電位的變化情況,具體測試結(jié)果如表3所示.

        表3 Tris-HCl緩沖溶液與含枯草芽孢桿菌酶溶液還原電位隨時間及電壓的變化

        備注:“+”表示氧化,“-”表示還原.

        由表3可知,胞內(nèi)酶的還原電位隨外加電壓增大,電位也在增加,而胞外酶基本無變化. 當(dāng)外加電壓達到15 V時,胞內(nèi)酶的還原電位為867 mV,高于靛藍所需要的還原電位760 mV,因此可用作靛藍電化學(xué)染色體系的還原劑.

        2.3 pH值對枯草芽孢桿菌胞內(nèi)酶電子傳遞能力的影響

        測試溫度為60 ℃,在不同pH值條件下,胞內(nèi)酶的電子傳遞能力,具體結(jié)果如表4所示.

        表4 不同pH值胞內(nèi)酶溶液的電子傳遞能力測試表

        由表4可知,酶體系在pH為11時導(dǎo)電能力最強,原因是胞內(nèi)酶在pH值為11時活性最強;另外1,8-二羥基-9,10-蒽醌不溶于中性或酸性水溶液中,在強堿性條件下溶解度較大,因此,溶液中溶解較多蒽醌也是導(dǎo)電性增強的原因之一.

        2.4 酶體系還原染料效果

        采用酶體系還原靛藍染料,并測定不同時間點隱色體的吸光度,具體結(jié)果如表5、圖1所示.

        表5 酶體系隱色體吸光度

        圖1 酶體系隱色體吸光度

        從圖1可知,隨著時間的推移,溶液中的隱色體濃度不斷增大,當(dāng)還原時間為40 min時,隱色體濃度達到最大,測試出的最大吸光度為0.402.在生物酶體系中,輔酶(NADH)先和枯草芽孢桿菌中提取的酶液形成絡(luò)合體系,此絡(luò)合體系中的NADH-還原酶先失去一個氫,變?yōu)镹AD-還原酶體,NAD-還原酶體系不穩(wěn)定,當(dāng)接觸到陰極銅管時,Cu給出一個電子使其變成穩(wěn)定的NADH還原酶結(jié)構(gòu),NADH還原酶將失去的電子傳給了1,8-二羥基-9,10-蒽醌(1,8-DHAQ),得到電子后,蒽醌中的羰基變?yōu)榱u基,被還原的蒽醌遇到靛藍,將電子傳遞給靛藍,靛藍首先被還原成不溶于水的隱色酸,隱色酸遇見氫氧化鈉變?yōu)榭扇苄缘碾[色體鈉鹽.當(dāng)還原時間超過40 min后,吸光度出現(xiàn)較小的下降趨勢,可能是生成的隱色體被氧氣氧化所造成.

        3 結(jié)論

        通過培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,分泌出酶,由測試可知具有還原能力的酶是胞內(nèi)酶,當(dāng)生物酶體系的外加電壓調(diào)至15 V時,胞內(nèi)酶的還原電位為867 mV,高于靛藍所需要的還原電位760 mV,可用做靛藍電化學(xué)染色體系的還原劑,且酶體系溫度為60 ℃,pH為11,還原時間為40 min時,對靛藍染料的還原效果最佳.

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