孔俐 文燕 劉真 吳平 孫楊 譚德文 張凌

(1重慶愛爾眼科醫(yī)院，重慶 400000；2重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院；3樂山市人民醫(yī)院)

白內(nèi)障是由各種原因引起晶狀體代謝紊亂導(dǎo)致的晶狀體蛋白變性發(fā)生的渾濁，中老年人為多發(fā)人群〔1〕。miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，可通過誘導(dǎo)靶基因降解或阻遏其翻譯過程而沉默該基因的表達(dá)進(jìn)而參與細(xì)胞生長發(fā)育、凋亡過程〔2〕。miR-181a屬miR-181家族，能通過與多個(gè)基因靶向調(diào)節(jié)，調(diào)控細(xì)胞的生長與凋亡，有研究表明，在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體內(nèi)異常表達(dá)〔3〕，沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1是已被證實(shí)的miR-181靶基因之一，可延長細(xì)胞壽命，延緩細(xì)胞凋亡〔4〕。但關(guān)于miR-181a是否調(diào)控SIRT1中相關(guān)蛋白的表達(dá)而參與白內(nèi)障的發(fā)生及發(fā)展的研究尚未見報(bào)道〔5〕，因此本研究探討白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞組織中miR-181a、SIRT1表達(dá)水平及二者表達(dá)相關(guān)性，為臨床治療年齡相關(guān)性白內(nèi)障提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1～9月在重慶愛爾眼科醫(yī)院診斷為年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者62例為白內(nèi)障組，術(shù)中收集晶狀體前囊膜標(biāo)本，置于液氮中保存，其中男28例，女34例；年齡55～75歲，平均年齡(62.13±8.72)歲；平均病程(3.12±1.14)年。另選取同期來醫(yī)院就診近視矯正手術(shù)42例為對照組，其中男19例，女23例；年齡21～34歲，平均年齡(27.31±6.64)歲；平均病程(3.56±0.82)年。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無青光眼、白內(nèi)障、眼部發(fā)炎等眼部疾??；最佳矯正視力≥0.5；晶狀體透明。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：排除其他類型白內(nèi)障、外傷、青光眼等眼部疾??；最佳矯正視力<0.5；無心臟病、高血壓等氧化損傷相關(guān)性疾?。涣严稛粝掠^察晶狀體，根據(jù)國際晶狀體渾濁分級標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，晶狀體混濁程度達(dá)N2或以上。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1晶狀體上皮細(xì)胞前處理 對照組在實(shí)施屈光手術(shù)中進(jìn)行前囊膜環(huán)形撕囊，直徑約為6 mm。生理鹽水清洗，置于EP管，-80℃冰箱保存。白內(nèi)障患者組，進(jìn)行白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)，術(shù)中前囊膜環(huán)形撕囊，直徑約為6 mm。生理鹽水清洗，置于EP管，-80℃冰箱保存。

1.2.2RT q-PCR法檢測晶狀體上皮細(xì)胞組織中miR-181a和SIRT1 mRNA表達(dá)量 取上述液氮保存的晶狀體上皮細(xì)胞組織，按照Trizol試劑盒說明書操作提取組織總RNA，按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix試劑說明配反應(yīng)體系并加樣。RT q-PCR反應(yīng)體系共為20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，雙蒸水ddH2O 6.0 μl。完成后將其放入熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)定為：95℃ 5 s，95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，共41個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。其中miR-181a以RNU6B為內(nèi)參基因，SIRT1以β-actin為內(nèi)參基因，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)結(jié)束后整理數(shù)據(jù)，并對所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法〔7〕計(jì)算miR-181a和SIRT1 mRNA的相對表達(dá)量。

表1 RT q-PCR引物序列

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人晶狀體上皮細(xì)胞系(SRA01/04)，購于中科院細(xì)胞系，從液氮罐中取出裝有細(xì)胞系SRA01/04凍融管，0℃解凍，采用DMEM培養(yǎng)基，包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的新生牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml 鏈霉素，37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)入離心管，10 000 r/min冷凍離心5 min，棄上清，加入DMEM重懸細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱孵育，細(xì)胞傳代3代后進(jìn)行細(xì)胞接種，以4×105/孔接種到4孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。分為4組：模擬物陰性對照組、miR-138a模擬物組、抑制物陰性對照組和miR-138a抑制物組，每孔均加入1.5 μl細(xì)胞轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體(Lipofectamine RNAiMAX)，此外在4孔內(nèi)分別加入0.7 μl、濃度為20 μmol/L的模擬物陰性對照物、miR-138模擬物、抑制物陰性對照物、miR-138a抑制物(20 μmol/L)。2 d后用1.2.2中方法檢測各組SIRT1表達(dá)水平。

1.2.4氧化應(yīng)激因子水平測定 取晶狀體上皮細(xì)胞標(biāo)本3 mm×3 mm，加入pH 7.3的磷酸緩沖液，渦旋震蕩，-4℃冷凍離心，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行定量檢測，檢測指標(biāo)為超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱氨酸(GSH)、谷胱氨酸過氧化物酶(GSH-Px)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-181a和SIRT1 mRNA表達(dá)水平 與對照組相比，白內(nèi)障組miR-181a表達(dá)水平顯著升高，SIRT1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 兩組miR-181a和SIRT1 mRNA表達(dá)水平比較

與白內(nèi)障組比較：1)P<0.05；表3同

2.2晶狀體上皮細(xì)胞組織中miR-181a和SIRT1表達(dá)的相關(guān)性 miR-181a和SIRT1呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.719，P<0.05)。見圖1。

圖1 晶狀體上皮細(xì)胞組織中miR-181a和SIRT1表達(dá)的相關(guān)性

2.3miR-181a調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞中SIRT1表達(dá) miR-181a模擬物組SIRT1表達(dá)水平顯著低于模擬物陰性對照組(0.58±0.03 vs 1.01±0.07;t=42.966,P=0.000)；miR-181a抑制物組SIRT1表達(dá)水平顯著高于抑制物陰性對照組(1.26±0.08 vs 1.02±0.05;t=17.276,P=0.000)。

2.4兩組氧化應(yīng)激水平比較 白內(nèi)障組SOD、GSH、GSH-Px水平明顯低于對照組(P<0.05)，MDA水平明顯高于對照組(P<0.05)，見表3。

2.5miR-181a和SIRT1與氧化應(yīng)激水平相關(guān)性 miR-181a表達(dá)水平與SOD、GSH、GSH-Px因子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.702，-0.739，-0.776)，與MDA水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.679)；SIRT1表達(dá)水平與SOD、GSH、GSH-Px呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.699，0.743，0.763)，與MDA水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.684)，見圖2、圖3。

表3 兩組氧化應(yīng)激水平比較

圖2 miR-181a表達(dá)水平與氧化應(yīng)激水平相關(guān)性

圖3 SIRT1表達(dá)水平與氧化應(yīng)激水平相關(guān)性

3 討 論

白內(nèi)障是晶狀體調(diào)節(jié)功能失常引起的晶狀體混濁，視物困難，多發(fā)于中老年人，發(fā)病率與致盲率均居首位〔8〕。目前手術(shù)是治療白內(nèi)障的唯一有效手段，取出混濁晶狀體核，吸出皮質(zhì)留下晶狀體后囊，術(shù)后即刻恢復(fù)視力〔9〕。目前白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，大量試驗(yàn)表明氧化應(yīng)激損傷是白內(nèi)障發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素〔10〕，貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)高于年齡因素與環(huán)境因素〔11〕，已得到學(xué)術(shù)界認(rèn)可。正常晶狀體存在抗氧化機(jī)制遞質(zhì)外界氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過SOD、GSH、GSH-Px活性對氧化應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng)，在此過程中MDA水平下降，隨著年齡增加自由基產(chǎn)生過快超過機(jī)體清除能力〔12〕，晶狀體氧化損傷，致使晶狀體渾濁。miR-181a和SIRT1與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，馬懿等〔13〕研究表明提升SIRT1水平可對抗氧化應(yīng)激引起的大鼠血管平滑肌細(xì)胞衰老；周曦等〔14〕研究結(jié)果表明SIRT1在可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中起重要作用；邴森等〔15〕研究表明miR-181a可調(diào)控過氧化氫誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化損傷，在H9c2細(xì)胞氧化損傷過程中起關(guān)鍵作用。

SIRTA是輔酶Ⅰ依賴的去乙酰化酶，通過去乙?；M蛋白與非組蛋白，在細(xì)胞的生存凋亡中發(fā)揮重要作用，可延長細(xì)胞壽命，延緩細(xì)胞凋亡，正常晶狀體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)可防御外界氧化應(yīng)激損傷，隨著年齡增加，晶狀體抗氧化系統(tǒng)逐漸退化，引起白內(nèi)障等眼部疾病發(fā)生。Jaliffa等〔16〕在成年鼠眼角膜晶狀體均發(fā)現(xiàn)SIRT1表達(dá)，主要定位于晶狀體上皮細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，鄭天玉〔17〕在人晶狀體上皮細(xì)胞SIRT1表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞SIRT1明顯低表達(dá)。本研究結(jié)果說明白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中SIRT1表達(dá)水平明顯上調(diào)，揭示其與白內(nèi)障的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。miR-181a屬miR-181家族，能通過與多個(gè)基因靶向調(diào)節(jié)，調(diào)控細(xì)胞的的生長與凋亡。本研究結(jié)果提示白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-181a表達(dá)水平明顯上調(diào)，其與白內(nèi)障的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)；miR-181a的過表達(dá)影響SIRT1的表達(dá)，miR-181a可能在白內(nèi)障患者的遷移過程中發(fā)揮重要作用，可通過上調(diào)表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞凋亡進(jìn)而對患者病情產(chǎn)生不利影響。本研究結(jié)果證實(shí)miR-181a高表達(dá)和SIRT1低表達(dá)與氧化應(yīng)激系統(tǒng)受損密切相關(guān)，與陳星等〔18〕結(jié)果類似。

綜上所述，miR-181a在白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中高表達(dá)，SIRT1呈低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，miR-181a可調(diào)控SIRT1表達(dá)，miR-181a高表達(dá)和SIRT1低表達(dá)與氧化應(yīng)激系統(tǒng)受損密切相關(guān)。由于樣本量不足及時(shí)間因素，本研究存在一定不足之處，關(guān)于miR-181a與SIRT1在白內(nèi)障發(fā)生過程中的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。