劉嘉慶 張大偉 李光

(1中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放療科，遼寧 沈陽 110001；2長春市人民醫(yī)院普通外科)

胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第二位，死亡率居惡性腫瘤的第六位〔1〕。我國胃癌發(fā)病人口和死亡人口超過世界的40%〔2，3〕。胃癌的發(fā)生涉及多基因、多蛋白的改變過程，因此發(fā)現(xiàn)針對胃癌治療的靶基因有重要的臨床意義。內皮素(ET)是由21種氨基酸殘基組成的具有血管活性的多肽，在諸多惡性腫瘤中呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)，其中以ET-1表達更為突顯。P53基因是人體抑癌基因，其失活對腫瘤形成起重要作用，本研究探討胃癌組織中ET-1、P53基因的表達與胃癌病理因素的關系及ET-1與P53基因的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2019年1～10月住院治療的50例胃癌患者為胃癌組，其中女25例，男25例。年齡45～75〔平均(60±5.8)〕歲。術后明確病理診斷為胃癌，胃癌分期以2010國際抗癌聯(lián)盟公布的病理、腫瘤、淋巴結(PTNM)分期為標準。其中乳頭狀腺癌10例，管狀腺癌15例，低分化腺癌15例，黏液腺癌5例，印戒細胞癌5例。同時將距離腫塊邊緣5 cm外的對應癌旁正常組織50例作為對照組。納入標準：(1)術前均行胃鏡檢查，明確病理診斷為胃癌；(2)未接受過放、化療或靶向治療；(3)預期生存期>3個月；(4)心、肝、腎等主要臟器功能基本正常。排除標準：(1)接受過放、化療或靶向治療；(2)骨轉移患者、存在嚴重的骨質疏松；(3)存在嚴重或不能控制的全身性疾病的證據(jù)；(4)無法控制的活動性感染；(5)各類傳染病?；颊咭话阗Y料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均知情同意，并經(jīng)倫理委員會批準。

1.2實驗試劑 ET-1-P53兔抗人多克隆抗體，免疫組化試劑盒購自長春可研生物有限公司。

1.3實驗方法 標本均采用10%甲醛溶液固定。常規(guī)石蠟包埋、切片、染色。取石蠟組織常規(guī)連續(xù)切片，厚約4 μm。步驟分別如下：

胃癌組織ET-1檢測：采用免疫組化法(IHC)測定，所檢測標本用ABC法標記。具體步驟如下：①制作石蠟切片；②脫蠟；③去除內源酶 3%H2O215 min；④蒸餾水與0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)浸洗；⑤一抗：兔抗大鼠ET-1抗血清(上海德波生物技術有限公司)1∶400，4℃過夜孵育；⑥PBS 浸洗；⑦二抗：生物素化羊抗兔抗血清1∶500，37℃ 30 min；⑧PBS浸洗；⑨三抗：ABC復合物，1∶100，37℃40 min；⑩二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，5 min。每例切片選5個高倍視野(×400)，隨即選測80～100個ET-1細胞的吸光度值，計算平均吸光度值，以平均值(A)表示細胞中的ET-1的含量。

利用常規(guī)的ABC法對P53蛋白進行檢測，微波修復抗原。采用免疫組化En Vision二步法，實驗步驟按照試劑盒說明書操作。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性組織作陽性對照。按照染色的強度計分，0分為無色，1分為淺色、2分為棕色、3分為褐色。陽性細胞百分比按照總分3分來測定，≤0.05是0分，0.06～0.25為1分，0.26～0.50為2分，≥0.51為3分。

1.4結果判定 ET-1表達主要位于細胞質，細胞膜呈少量的陽性表達，出現(xiàn)淡黃色或棕色顆粒者為陽性表達，若陽性細胞在標記的細胞總數(shù)中超過60%以上者，標記為陽性病例。P53蛋白表達位于細胞核，呈現(xiàn)淡黃色或棕色顆粒分布為陽性細胞。在光學顯微鏡下進行觀察大于5個高倍視野，計數(shù)≥1 000個細胞中的陽性細胞，陽性細胞數(shù)<10%為陰性，≥10%為陽性。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗和Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1兩組ET-1和P53蛋白的表達 胃癌組ET-1和P53蛋白表達陽性率〔38例(76.0%)，41例(82.0%)〕均顯著高于對照組〔11例(22.0%)，10例(20.0%)；P<0.05〕。

2.2胃癌組織中ET-1和P53的表達與臨床病理因素的關系 有無淋巴結轉移、不同臨床分期患者ET-1和P53蛋白陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。組織學分級患者ET-1和P53蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中ET-1和P53表達與臨床病理因素的關系〔n(%)〕

2.3ET-1和P53蛋白表達的相關性 ET-1和P53蛋白共同陽性32例，共同陰性3例，二者呈正相關(r=0.511,P=0.000)。

3 討 論

ET是1988年由Yanagisawa等〔4〕首次從培養(yǎng)的豬主動脈內皮細胞上清液中分離并純化出來的，由21種氨基酸殘基組成的血管活性多肽。ET由血管內皮細胞產(chǎn)生釋放，以極低的生理濃度釋放，其中以ET-1生理作用最強，在惡性腫瘤患者血清中ET-1濃度最高，其主要作用于周圍淋巴結，在腫瘤侵襲中表現(xiàn)出器官特異性〔5〕。在乳腺癌患者的血清中ET-1水平明顯增高，且與腫瘤惡性程度呈正比〔6〕，浸潤性癌中ET-1過度表達并激活水平基因轉移(HGT)，從而促使其發(fā)生骨轉移〔7〕。ET不但能促使癌細胞淋巴管生成〔8〕，還能促進惡性腫瘤新生血管形成〔9〕，為腫瘤侵襲轉移提供重要理論基礎。

P53蛋白基因包括野生型和突變型，野生型P53蛋白基因位于染色體17p13.1〔10〕，屬于細胞調控基因。當細胞受到損傷時，野生基因可有效誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡〔11〕，使得細胞在新的周期內得到修復和恢復，進而有效抑制腫瘤發(fā)生〔12〕。野生型P53蛋白半衰期較短，IHC在有效檢測過程中不易檢測到，在腫瘤組織的檢測中，一般檢測出的P53蛋白是經(jīng)過突變后得到的P53蛋白〔13〕。

本研究結果表明ET-1和P53蛋白表達升高在胃癌發(fā)生過程中有一定的作用。有研究表明，ET-1能夠使得P53蛋白基因發(fā)生突變，P53蛋白基因通過加強細胞轉化加快惡化，在腫瘤治療時起到有效抵制的作用。ET-1和P53蛋白異常表達共同參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展過程。本文結果與國內研究相一致〔14〕，說明ET-1是由癌組織本身分泌或釋放的一種物質，其在血清中也呈高表達〔14〕。

綜上，ET-1和P53蛋白表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移之間存在一定的聯(lián)系，能夠在胃癌的早期檢測和預后評估及靶向治療中提供依據(jù)〔15〕。ET-1和P53蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展的過程中相互調節(jié)的有效機制需進一步研究。