趙曉輝 黃詠 王秀艷 王立波

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154002)

根據(jù)WHO公布的資料顯示，每年約有380萬例男性及340萬例女性死于冠心病(CHD)，占全部死亡的12.2%，CHD已成為全世界人群引起死亡的首要原因。臨床證實，CHD發(fā)生及發(fā)展與年齡、性別、高血壓、高血糖、高血脂、高鹽飲食及吸煙關(guān)系密不可分，在以上多重危險因素的參與下形成復雜的致病機制，其中血脂沉積是其最明確也是最重要的獨立危險因素。

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素(PCSK)9是一種絲氨酸蛋白酶，通過低密度脂蛋白(LDL)受體(LDLR)調(diào)節(jié)肝臟載脂蛋白(Apo)B攝取和膽固醇代謝〔1,2〕。在臨床中，升高的ApoB 與動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展有關(guān)〔3,4〕。 Canvex等〔5〕表明 PCSK9 可以與 ApoB 的 N-末端區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列結(jié)合，并且在小鼠原代肝細胞中 PCSK9 的過表達誘導了 ApoB100 的生物合成。這反過來可能增加血漿LDL水平并導致高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化。PCSK9功能獲得性突變體可結(jié)合肝細胞表面LDLR，通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入肝細胞，在酸性pH下加強二者的結(jié)合能力，增加LDLR在溶酶體的降解，阻止LDLR循環(huán)至細胞表面，使LDL-膽固醇(C)清除率下降，增加血清LDL-C水平，最終導致動脈粥樣硬化的形成〔6，7〕。極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒殘留物是ApoB脂蛋白殘留物，被認為是致動脈粥樣硬化脂蛋白〔8,9〕。PCSK9作為ApoB脂蛋白的新靶點，可以調(diào)節(jié)ApoB脂蛋白降解和膽固醇代謝〔10～12〕。因此推薦在持續(xù)大劑量用他汀類藥物后，仍存在高 LDL-C 的患者中使用 PCSK9 抑制劑〔13,14〕。本文擬分析PSK9基因第8、9外顯子多態(tài)性與CHD相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2017年3月至2018年11月因胸悶、胸痛、呼吸困難及存在疑似冠脈狹窄的表現(xiàn)而入院接受冠脈血管造影(CAG)確診CHD者為CHD組共303例，非CHD者為對照組共233例。在接受試驗前均詳細告知具體流程、注意事項及風險性，研究對象知曉并同意。CHD組納入標準：經(jīng)CAG確診至少一支主要的冠脈狹窄程度≥50%。排除標準：非黑龍江省東部地區(qū)人(在黑龍江省東部主要城市居住不足10年)、非漢族人群、肝腎疾患、甲狀腺疾病、心肌梗死、腦卒中或短暫性腦出血發(fā)作、癌癥或當前有腎臟、甲狀腺、肝臟系統(tǒng)疾病的外周血管疾病、炎癥性疾病、慢性心力衰竭。

1.2流行病學調(diào)查 收集并整理性別、年齡、血壓、血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、LDL-C、飲酒、吸煙等一般資料與臨床資料。

1.3血標本采集 均于空腹8 h后用普通生化管抽取外周靜脈血2 ml，并借助全自動生化分析儀進行血脂水平等的檢測；另外用含乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管抽取外周靜脈血3 ml用于DNA的粗提取。

1.4DNA提取 采用北京(索來寶)生物科技有限公司全血基因組DNA提取試劑盒。

1.5測序及分析 將所得產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行基因測序，測序結(jié)果應用SnapGene及Chromes 等相關(guān)軟件查看峰圖文件，通過雙向測序結(jié)果識別PCSK9基因第8、9外顯子單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，同時與基因庫中相關(guān)序列進行對比分析。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行t、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1基線資料 CHD組高血壓、糖尿病、吸煙人數(shù)均顯著多于對照組(P<0.01)；CHD組年齡明顯高于對照組(P<0.05)。CHD組血漿TG、TC和LDL-C水平均顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般臨床資料及臨床資料比較

2.2PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果 基因遺傳規(guī)律符合Hardy-Weinberg平衡定律。經(jīng)過序列比對，在第8外顯子未發(fā)現(xiàn)基因突變位點。在第9外顯子有3處突變位點：c.477 T>C 、c.604 C>T、c.606 C>T，突變頻率分別是0.37%、1.67%、0.93%，均為錯義突變。其中，對照組c.477 T>C突變位點，CHD組c.604 C>T、c.606 C>T氨基酸改變?yōu)門〔Thr〕?M〔Met〕,C〔Cys〕?K〔Arg〕。

2.3PCSK9基因第9外顯子突變位點與血脂相關(guān)性 對照組中c.477 T>C突變2例血清LDL-C濃度水平〔(2.98±0.08)mmol/L〕與未突變231例〔(2.47±0.58)mmol/L〕無明顯差異(t=1.25,P=0.214)。CHD組中基因位點c.604 C>T突變9例與非突變289例LDL-C濃度水平〔(3.06±0.69)vs(2.65±0.82)mmol/L〕有明顯差異(t=-1.499,P=0.036)。CHD組中基因位點c.606 C>T突變5例與非突變289例血清LDL-C濃度水平〔(2.57±0.53)vs(2.65±0.82)mmol/L〕無明顯差異(t=0.227,P=0.810)。

3 討 論

本實驗發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿病、吸煙、TC、LDL-C是CHD的危險因素，與國內(nèi)外〔6～13〕報道一致。

PCSK9被發(fā)現(xiàn)與家族性高膽固醇血癥相關(guān)〔15〕，PCSK9可通過多種途徑調(diào)節(jié)循環(huán)血清LDL-C水平，同時PCSK9引起的炎癥反應和細胞生物學功能等過程的參與也對CHD產(chǎn)生直接作用，并且PCSK9基因突變則可通過改變其編碼蛋白的功能介導CHD發(fā)病。通過對比NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_009061.1)，證實PCSK9基因共含有12個外顯子，其中第8、9外顯子翻譯的蛋白質(zhì)具有重要作用?；騝.477 T>C突變屬于功能缺失型突變，其編碼蛋白不引起血清LDL-C水平的改變；其次，樣本量偏少，不明確突變后編碼蛋白的作用機制，不足以提供確切信息，需進一步探討。突變位點c.606 C>T改變編碼蛋白，故該突變位點屬于功能缺失型突變。突變位點c.604 C>T突變體與血清LDL-C濃度有關(guān)，對比NCBI，該突變位點改變編碼蛋白。

綜上所述，PCSK9第9外顯子基因突變可能與CHD發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。