徐偉軍 王明新 夏文強(qiáng)

1．北京核工業(yè)醫(yī)院房山院區(qū)骨科，北京102488

2．中國(guó)人民解放總醫(yī)院第三臨床中心關(guān)節(jié)四肢科，北京100039

3．北京豐臺(tái)醫(yī)院骨科，北京100071

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)升高為特征的全身代謝性骨病。骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥，骨質(zhì)疏松患者一旦發(fā)生骨折，生活質(zhì)量急劇下降，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。因此，OP的預(yù)防比治療更為現(xiàn)實(shí)和重要。雌激素缺乏被認(rèn)為是導(dǎo)致OP的重要原因之一，雌激素替代療法(estrogen replacement theropy，ERT)目前是防治OP的治療方案之一［2］。甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是由甲狀旁腺主細(xì)胞合成分泌，作為調(diào)節(jié)鈣、磷代謝水平的生物活性物質(zhì)，可調(diào)節(jié)骨的合成和分解代謝，對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、成熟、凋亡發(fā)揮重要作用［3］。PTH已在中國(guó)獲批用于治療有骨折高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥(PMO)。因此，本研究試圖探討甲狀旁腺素聯(lián)合雌二醇對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的治療作用，為臨床治療OP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)雌性SD大鼠100只，10周齡，體重180～270 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［許可證號(hào):SYXK(京)2017－0033］;重組人甲狀旁腺激素(1－34)(100 μg/支，批號(hào):1708072，美國(guó)Sigma公司);苯甲酸雌二醇注射液(1 mg/支，批號(hào):1711104，上海通用藥業(yè)股份有限公司);Ca、P、ALP試劑盒(批號(hào):201835，南京建成生物工程公司);大鼠COL－I、OC、OPG 試劑盒(批號(hào):201709，美國(guó) R﹠D公司);全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào):7 170 A，日本日立公司);雙能X線骨密度測(cè)定儀(型號(hào):LUNAR－Prodigy，美國(guó)GE公司);生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)(型號(hào):MTS－858，美國(guó) MA 公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理:將100只雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、去勢(shì)組、甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯(lián)合用藥組，每組20只。假手術(shù)組僅切除部分脂肪組織，去勢(shì)組、甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯(lián)合用藥組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。造模成功后第2天給予藥物干預(yù):假手術(shù)組、去勢(shì)組皮下注射0.9%氯化鈉，每日1次;甲狀旁腺素組皮下注射PTH(1－34)50 μg/kg，每日1次;雌二醇組肌肉注射苯甲酸雌二醇1 mg，每?jī)扇?次;聯(lián)合用藥組皮下注射PTH(1－34)50 μg/kg，每日 1 次，肌肉注射苯甲酸雌二醇1 mg，每?jī)扇?次。

1.2.2 構(gòu)建動(dòng)物模型:參照駱陽(yáng)等［4］構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型方法。造模成功后第2天給予各組藥物干預(yù)，各組大鼠均分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，照明、通風(fēng)、溫度、濕度等飼養(yǎng)環(huán)境條件均相同。

1.2.3 標(biāo)本取材與處理:給藥干預(yù)6周后，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血約5 mL，3 000 r/min，離心10 min，收集上層血清，－20℃保存?zhèn)溆?，待骨代謝生化指標(biāo)和標(biāo)志物檢測(cè)。逐層剝離大鼠L4腰椎和股骨，以無(wú)菌生理鹽水濕紗布包裹置于－20℃的冰箱保存?zhèn)溆?，以行腰椎、股骨骨密度和生物力學(xué)檢測(cè)。另留取股骨經(jīng)0.9%氯化鈉沖洗后置于10%甲醛溶液中固定，經(jīng)10%EDTA處理6周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm厚切片，置于60℃烤箱4 h，取出室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 骨組織骨密度測(cè)定:取出待測(cè)大鼠L4腰椎和右側(cè)股骨，通過(guò)LUNAR雙能X線吸收掃描儀測(cè)量，采用小物體掃描模式，以分辨率1.0 mm×1.0 mm、掃描速度60 mm/s、掃描寬度5.0 cm的參數(shù)值，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，讀出骨密度值。

1.2.5 大鼠骨生物力學(xué)檢測(cè):將大鼠右側(cè)股骨置于MTS－858型電子生物力學(xué)材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)，儀器調(diào)試正常后固定骨標(biāo)本在同一位置，以右股骨橫切面為準(zhǔn)，以中點(diǎn)為加壓點(diǎn)，支點(diǎn)跨距為20 mm，加載速度2 mm/min，給予股骨載荷，計(jì)算機(jī)記錄儀記錄載荷位移曲線，測(cè)定生物力學(xué)變化，骨生物力學(xué)包括最大載荷和剛度。

1.2.6 骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè):取出上清液，采用7 170 A全自動(dòng)生化分析儀免疫比濁法檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo):血鈣(Ca)、血磷(P)、血堿性磷酸酶(ALP)，均按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。室溫平衡，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，加樣，溫育，稀釋，洗滌，顯色，終止反應(yīng)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出血清Ca、P、ALP濃度。

1.2.7 骨代謝標(biāo)志物檢測(cè):采用ELISA法測(cè)定血清COL－I、OC、OPG含量，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。試劑盒室溫平衡，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，37℃溫育，稀釋配液，洗滌液洗滌，顯色劑顯色，終止反應(yīng)，以空白組調(diào)零、450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度值(OD值)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出血清COL－I、OC、OPG 的濃度。

1.2.8 HE染色:取出切片，脫蠟，水化，沖洗，蘇木精染色，流水沖洗，鹽酸酒精分化，流水沖洗，返藍(lán)，蒸餾水洗滌，伊紅染色，流水沖洗，脫水，透明，封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“珋x±s”表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析，組間比較采用 SNK法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨組織骨密度

去勢(shì)組腰椎(L4)和股骨骨密度(bone mineral density，BMD)較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯(lián)合用藥組腰椎(L4)和股骨BMD均較去勢(shì)組增高，其中以聯(lián)合用藥組增高最為顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1各組大鼠腰椎和股骨BMD比較(珋x±s)Table 1 Comparison of BMD of lumbar vertebrae and femur between each group(珋x±s)

2.2 骨生物力學(xué)

去勢(shì)組股骨最大載荷和剛度較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯(lián)合用藥組股骨最大載荷和剛度均較去勢(shì)組顯著增高，其中尤以聯(lián)合用藥組增高最為顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2各組大鼠股骨生物力學(xué)比較(珋x±s)Table 2 Comparison of femur biomechanical parameters between each group(珋x±s)

2.3 骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)

去勢(shì)組血清 Ca、P顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯(lián)合用藥組血清Ca、P均高于去勢(shì)組，其中尤以聯(lián)合用藥組增高最為顯著(P＜0.05);去勢(shì)組血清ALP顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯(lián)合用藥組血清ALP較去勢(shì)組降低，其中尤以聯(lián)合用藥組降低最顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)比較(珋x±s)Table 3 Comparison of serum bone metabolism markers between each group(珋x±s)

2.4 骨代謝標(biāo)志物

去勢(shì)組血清COL－I、OC、OPG顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，甲狀旁腺素組、雌二醇組、聯(lián)合用藥組血清COL－I、OC、OPG均較去勢(shì)組降低，其中尤以聯(lián)合用藥組降低最顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4各組大鼠血清骨代謝標(biāo)志物比較(珋x±s)Table 4 Comparison of serum bone metabolism markers between each group(珋x±s)

2.5 骨組織病理學(xué)

假手術(shù)組骨組織結(jié)構(gòu)完整，現(xiàn)大量骨小粱，致密粗壯，形態(tài)規(guī)則，連接較好，排列齊整。去勢(shì)組骨組織呈骨質(zhì)疏松特征性表現(xiàn)，骨小梁少見(jiàn)，細(xì)小稀疏，小梁間斷裂分離，間隙增大，排列疏松紊亂，骨板層結(jié)構(gòu)疏松。甲狀旁腺素組和雌二醇組骨組織結(jié)構(gòu)相對(duì)較完整，骨小梁變粗變密，形態(tài)相對(duì)規(guī)則，連續(xù)性較好，排列尚規(guī)則致密，且骨小梁數(shù)多于去勢(shì)組。聯(lián)合用藥組骨組織結(jié)構(gòu)完整，大量骨小梁，致密均勻粗壯，形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整，連續(xù)性好呈網(wǎng)狀，結(jié)構(gòu)致密。見(jiàn)圖1。

圖1HE染色觀察骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200)A:假手術(shù)組;B:去勢(shì)組;C:甲狀旁腺素組;D:雌二醇組;E:聯(lián)合用藥組。Fig．1 Observation of morphological changes of bone tissue by HE staining(×200)

3 討論

雌激素水平降低是導(dǎo)致OP的重要原因之一，主要機(jī)制為雌激素缺乏導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的比例失衡，骨轉(zhuǎn)換加快，骨吸收增強(qiáng)，骨形成減少，骨量丟失，導(dǎo)致OP發(fā)生［5］。雌激素可以抑制骨質(zhì)疏松性骨量丟失［6］。雌激素在骨代謝方面起著重要作用，應(yīng)用 ERT和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)是防治OP、減少OPF發(fā)生的有效措施［7］。

雌激素抗骨質(zhì)疏松作用主要是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞骨吸收和促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成實(shí)現(xiàn)的，雌激素可通過(guò)鈣調(diào)節(jié)激素間接對(duì)骨骼起作用，促進(jìn)降鈣素的分泌，降低破骨細(xì)胞活性，降低骨對(duì)PTH敏感性，抑制骨吸收，增強(qiáng)肝臟25－羥化酶和腎臟1α－羥化酶的活性，增加1，25－(OH)D3的生成與活性，促進(jìn)鈣吸收［8］;又可通過(guò)作用于成骨細(xì)胞雌激素受體(ER)，激發(fā)成骨細(xì)胞活性，增加骨量骨密度，提高骨質(zhì)量，發(fā)揮骨暈影響效應(yīng)，打破成骨與破骨效應(yīng)平衡環(huán)境［9］。同時(shí)還可通過(guò)抑制白介素－1、白介素－6、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子合成和分泌，抑制骨吸收，促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－R(TGF－R)及胰島素樣生長(zhǎng)因子－I(IGF－1)增加，促進(jìn)骨形成［10］。

PTH是骨代謝過(guò)程中調(diào)節(jié)血鈣、血磷水平重要的調(diào)節(jié)因子［11］。PTH可精細(xì)調(diào)節(jié)骨的合成和分解代謝，對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、成熟、凋亡發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用，不僅可增加成骨細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)成骨細(xì)胞釋放骨生長(zhǎng)因子，增加骨量，提高骨密度，促進(jìn)骨形成;而且也可通過(guò)增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收，使骨鈣釋放入血［12］。同時(shí)PTH還可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)膠原合成和骨組織礦化，抑制成骨細(xì)胞凋亡［13］。此外，PTH還能增加遠(yuǎn)球小管對(duì)鈣的重吸收，減少近球小管對(duì)血磷的重吸收，從而升高血鈣，降低血磷［14］。PTH(1－34)是 PTH 中具有活性的氨基酸序列，PTH(1－34)能顯著升高骨密度，增加骨量，改善骨結(jié)構(gòu)，刺激骨形成，降低骨折發(fā)生率，在臨床骨質(zhì)疏松治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果表明去勢(shì)組腰椎和股骨BMD、股骨最大載荷和剛度及血清Ca、P水平均較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.05)，而聯(lián)合用藥組上述指標(biāo)均較去勢(shì)組顯著增高(P＜0.05)。去勢(shì)組血清 ALP、COL－I、OC、OPG水平較假手術(shù)組顯著增高(P＜0.05)，而聯(lián)合用藥組上述指標(biāo)均較去勢(shì)組顯著降低(P＜0.05)。去勢(shì)組骨組織呈骨質(zhì)疏松特征性表現(xiàn)，骨小梁少見(jiàn)，細(xì)小稀疏，小梁間斷裂分離，間隙增大，排列疏松紊亂，骨板層結(jié)構(gòu)疏松;聯(lián)合用藥組骨組織結(jié)構(gòu)完整，大量骨小梁，致密均勻粗壯，形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整，連續(xù)性好呈網(wǎng)狀，結(jié)構(gòu)致密。楊力等［15］的研究表明雌激素和PTH可使去卵巢大鼠松質(zhì)骨骨量增加、改善生物力學(xué)性能，兩者聯(lián)合治療具有協(xié)同作用。梁敏等［16］證實(shí)雌二醇和左炔諾孕酮聯(lián)合應(yīng)用可增加骨密度，降低骨轉(zhuǎn)換率。

綜上所述，甲狀旁腺素聯(lián)合雌二醇可調(diào)節(jié)維持骨質(zhì)疏松性骨代謝，提高骨密度，改善骨生物力學(xué)性能和骨組織病理形態(tài)學(xué)，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，起到骨保護(hù)作用，兩者聯(lián)合治療具有協(xié)同治療骨質(zhì)疏松作用。