朱麗璇 崔玥 羅靜

云南省第一人民醫(yī)院疼痛科，云南昆明650032

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨病，其特征在于骨量和密度的降低，主要致病原因是骨生成和骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞［1－2］，因此骨質(zhì)疏松癥患者發(fā)生脆性骨折的幾率會(huì)大大增加［3－4］，尤其是絕經(jīng)后婦女［5－6］。目前國內(nèi)采用锝［99Tc］亞甲基二膦酸鹽(99Tc－MDP)來治療骨質(zhì)疏松癥，它是我國自主研發(fā)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的一種藥物，可抑制人破骨細(xì)胞生成并通過改善松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨以及增加外在骨硬度來發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用［7－8］。有研究［9］報(bào)道，miR－338－3p調(diào)節(jié)小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化;miR－338－3p通過靶向核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor－κB ligand，RANKL)抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松［10］。而RANKL不僅可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，而且在骨質(zhì)疏松患者中高表達(dá)［11］。但是，99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向RANKL緩解骨質(zhì)疏松尚未有研究報(bào)道。因此，本研究旨在探究其中可能存在的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

在手術(shù)中抽取本院收治的骨質(zhì)疏松患者股骨上端液態(tài)的紅骨髓，用D－Hanker’s液等倍稀釋，離心獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用25－(OH)2D3誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞(osteoporosis－derived osteoclast，OC);99Tc－MDP購于成都云克藥業(yè)有限責(zé)任公司;TRIZOL以及蛋白提取試劑盒購于賽默飛公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司;免疫印跡一抗(GAPDH和RANKL鼠抗)和二抗(羊抗鼠)購于CST公司;SDS－PAGE凝膠制備試劑盒購于貝博生物;DMEM、胎牛血清以及青鏈霉素購于Gibco公司;CCK－8試劑盒購于碧云天生物科技有限公司;miR－338－3p mimics/inhibitor以及 sh－RANKL 購于百奧邁科生物技術(shù)有限公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:OC細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素、1×10－7mol/L地塞米松和 1×10－8mol/L 25－(OH)2D3的 DMEM 培養(yǎng)基中，并置于條件為37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3周。接種適量細(xì)胞于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體，過表達(dá)組將 miR－338－3p mimics轉(zhuǎn)染到破骨細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6～8 h后換液，并加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.299Tc－MDP制備:按照試劑商提供的操作手冊(cè)將試劑A(共有5 mL，含0.05 g99Tc)和試劑B(含5 mg MDP以及0.5 mg氯化亞錫)室溫混合5 min，最后調(diào)整原液濃度為1 μg/mL MDP。

1.2.3 qRT－PCR 檢測(cè) miR－338－3p、CD51、以及MMP－9表達(dá):收集對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用TRIZOL法進(jìn)行總RNA提取，并用Nanodrop定性以及定量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，反應(yīng)條件為37℃，15 min;85℃，5 s。隨后按照熒光定量PCR試劑盒說明檢測(cè)miR－338－3p以及CD51和MMP－9 mRNA表達(dá)，以GAPDH或U6作為參照，引物由擎科生物合成，序列如表1所示。數(shù)據(jù)由2－ΔΔCt方法處理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 CCK－8檢測(cè)OC細(xì)胞增殖:收集對(duì)數(shù)期OC細(xì)胞，接種至96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2預(yù)培養(yǎng)24 h。次日，向每孔加入10 μL CCK－8 溶液，培養(yǎng)箱孵育 2 h。隨后每 0、24、48、72、96 h檢測(cè)細(xì)胞在450 nm處吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)RANKL表達(dá):嚴(yán)格按照蛋白提取試劑盒說明提取細(xì)胞總蛋白，BCA定量。取等量蛋白加入上樣緩沖液95℃加入10 min。隨后用10%SDS－PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。去除脫脂奶粉，TBST清洗 3次，加入稀釋的一抗(RANKL，1∶1 000)4℃搖床孵育過夜?；厥找豢?，用TBST清洗PVDF膜3次，加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h。最后回收二抗，TBST清洗3次，加入化學(xué)發(fā)光顯色液，凝膠成像顯影，分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR－338－3p與RANKL靶向關(guān)系:通過TargetScan以及starBase數(shù)據(jù)庫查到miR－338－3p與RANKL結(jié)合的位點(diǎn)，用PCR擴(kuò)增后連接到質(zhì)粒中，構(gòu)建野生型質(zhì)粒。突變其結(jié)合位點(diǎn)，得到突變型質(zhì)粒。將 miR－338－3p mimics與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，隨后按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書檢測(cè)熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)圖片的繪制采用Graphpad軟件繪制。

組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 99Tc－MDP抑制OC細(xì)胞活性

qRT－PCR結(jié)果表明，99Tc－MDP能夠顯著下調(diào)OC細(xì)胞中破骨細(xì)胞活性標(biāo)志物CD51和MMP－9的表達(dá)水平，且呈劑量依賴性(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001，圖 1 A);CCK－8結(jié)果表明，隨著99Tc－MDP濃度增加，OC細(xì)胞存活率逐漸降低，半抑制濃度(IC50)為 14 ng/mL(圖 1B)。因此，99Tc－MDP 可以抑制OC細(xì)胞活性以及CD51和MMP－9的分泌。

圖1 99Tc－MDP抑制OC細(xì)胞活性及CD51和MMP－9的分泌 A:qRT－PCR檢測(cè)OC細(xì)胞中CD51和MMP－9 mRNA的表達(dá)水平;B:CCK－8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OC細(xì)胞存活率。Fig．1 99Tc－MDP inhibited the cell activity and the expression of CD51 and MMP－9 of OC cells

2.2 99Tc－MDP促進(jìn) miR－338－3p表達(dá)并抑制RANKL表達(dá)

分別在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0、5、14 ng/mL的99Tc－MDP，常規(guī)培養(yǎng)。qRT－PCR 結(jié)果表明，隨著99Tc－MDP濃度的增加，miR－338－3p表達(dá)水平顯著上升(P＜0.05或 P＜0.01，圖 2 A);Western blotting結(jié)果表明，RANKL表達(dá)隨著99Tc－MDP濃度升高顯著下調(diào)(P＜0.05或 P＜0.01，圖2B)。以上結(jié)果說明，99Tc－MDP 可以上調(diào) miR－338－3p，下調(diào) RANKL的表達(dá)水平。

圖2 99Tc－MDP促進(jìn)miR－338－3p表達(dá)且抑制RANKL表達(dá) A:qRT－PCR檢測(cè)OC細(xì)胞中miR－338－3p的表達(dá)水平;B:Western blotting檢測(cè)OC細(xì)胞中RANKL的表達(dá)水平。Fig．2 99Tc－MDP promoted the expression of miR－338－3p and suppressed the expression of RANKL

2.3 miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL

通過TargetScan和starBase數(shù)據(jù)庫分析得知，RANKL是miR－338－3p潛在下游靶點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)如圖3 A所示。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn) miR－338－3p mimics+RANKL－WT顯著降低熒光素酶活性(P＜0.01，圖3B);而共轉(zhuǎn)miR－338－3p mimics+RANKL－MUT 時(shí)熒光素酶活性與對(duì)照組無明顯差異。Western blotting結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR－338－3p可以顯著下調(diào) RANKL 表達(dá)(P＜0.05，圖 3C)。因此，miR－338－3p可以靶向結(jié)合RANKL并下調(diào)其表達(dá)。

2.4 99Tc－MDP通過 miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制OC細(xì)胞增殖及活性

圖3 miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL A:Targetscan生信網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR－338－3p與RANKL的結(jié)合位點(diǎn);B:雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR－338－3p與RANKL的靶向關(guān)系;C:Western blotting檢測(cè)OC細(xì)胞中RANKL的表達(dá)水平。Fig．3 miR－338－3p targeted RANKL and suppressed its expression

qRT－PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)基加入14 ng/mL99Tc－MDP 顯著上調(diào) miR－338－3p;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組 miR－338－3p表達(dá)顯著低于99Tc－MDP 組;而99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組 miR－338－3p表達(dá)顯著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 組(P＜0.01，圖 4 A)。Western blotting結(jié)果表明，99Tc－MDP 組RANKL表達(dá)顯著低于對(duì)照組;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組 RANKL表達(dá)顯著高于99Tc－MDP組;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 組RANKL表達(dá)顯著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組(P＜0.01，圖 4B)。CCK－8結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，加入14 ng/mL99Tc－MDP后，OC細(xì)胞增殖活力顯著降低;而99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組OC細(xì)胞增殖活力顯著高于99Tc－MDP組;99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor+sh－RANKL 組OC細(xì)胞增殖活力顯著低于99Tc－MDP+miR－338－3p inhibitor組(P＜0.01，圖 4C)。qRT－PCR 結(jié)果表明，OC細(xì)胞活性標(biāo)志物CD51以及MMP－9表達(dá)方面，99Tc－MDP 組顯著低于對(duì)照組;99Tc－MDP+miR－145 inhibitor組顯著高于99Tc－MDP 組;99Tc－MDP+miR－145 inhibitor+sh－MKK4 組顯著低于99Tc－MDP+miR－145 inhibitor組(P＜0.01，圖 4D)。因此，99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制OC細(xì)胞增殖及活性。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種常見疾病，其特征是低骨密度和低創(chuàng)傷性骨折，主要是由于成骨細(xì)胞的骨形成超過破骨細(xì)胞的骨吸收所致［12－13］。骨質(zhì)疏松癥是全球主要的公共衛(wèi)生問題之一，特別是在人口老齡化較多的國家，如中國［14］。99Tc－MDP 是中國自主研發(fā)的抗炎藥物，自1997年以來，它已被用于中國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎的安全治療［15］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，99Tc－MDP可用于治療骨質(zhì)疏松，但具體作用機(jī)制尚不完全明確。

microRNA是一種長(zhǎng)度僅有20～24 bp的非編碼RNA［16］。目前發(fā)現(xiàn)有 miRNAs可能與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR－422a可能是骨質(zhì)疏松癥的潛在生物標(biāo)志物［17］;miRNA－133a通過促進(jìn)破骨細(xì)胞分化參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的調(diào)節(jié)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR－338－3p在 OC細(xì)胞中低表達(dá)，并且隨著99Tc－MDP濃度的增加，miR－338－3p表達(dá)也顯著增加。此外，在99Tc－MDP作用下，過表達(dá)miR－338－3p顯著抑制OC細(xì)胞存活，且破骨細(xì)胞活性標(biāo)志物CD51以及MMP－9表達(dá)顯著下調(diào)。

MiRNA一般都是通過調(diào)控下游蛋白以參與疾病的發(fā)生發(fā)展。RANKL是腫瘤壞死因子(TNF)配體超家族的成員，由成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和活化的T細(xì)胞及B細(xì)胞表達(dá)［19］，并且RANKL可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成以及影響其功能［20］。此外，RANKL在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面與RANK結(jié)合，導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化和融合，并刺激成熟破骨細(xì)胞的活性［21］。有研究報(bào)道，在破骨細(xì)胞中miRNA能夠調(diào)控RANKL表達(dá)。例如，miR－302a－3p調(diào)節(jié)人下頜骨成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中的 RANKL表達(dá)［22］;25－h(huán)ydroxycholesterol通過在miR－139－5p的轉(zhuǎn)錄中協(xié)調(diào)NFATc1和Sp1復(fù)合物來促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成［23］。在骨質(zhì)疏松中，miR－338－3p通過靶向RANKL抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成［10］。本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL，并且敲降RANKL可以抑制OC細(xì)胞增殖以及活性標(biāo)志物CD51以及MMP－9表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制OC細(xì)胞增殖及活性從而緩解骨質(zhì)疏松發(fā)生。

綜上所述，本研究初步探討了99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制破骨細(xì)胞活性進(jìn)而緩解骨質(zhì)疏松發(fā)生可能的分子機(jī)制，為后期更深入的探究骨質(zhì)疏松治療方法提供了新的治療靶點(diǎn)和策略。

圖4 99Tc－MDP通過miR－338－3p靶向下調(diào)RANKL抑制OC細(xì)胞增殖及活性 A＆D:qRT－PCR檢測(cè)OC細(xì)胞中miR－338－3p、CD51和MMP－9 mRNA的表達(dá)水平;B:Western blotting檢測(cè)OC細(xì)胞中RANKL的表達(dá)水平;C:CCK－8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OC細(xì)胞增殖活力。Fig．4 99Tc－MDP inhibited the proliferation and cell activity of OC cells through miR－338－3p targeting and downregulating RANKL