楊藝新 紀(jì)可心 黃 銀 王思琦 李 敏*（天津師范大學(xué)，天津300387）

草履蟲（Paramecium caudatum Ehrenberg）屬原生動(dòng)物門纖毛綱膜口目草履蟲科，體型較小，一般體長(zhǎng)為180～280μm，其呈橢圓形，形狀酷似草鞋顧得名為草履蟲[1]。草履蟲的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，具有起攝食作用的胞口，控制氣體進(jìn)出的表膜，分別控制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出和遺傳生殖的作用的大小核，輔助運(yùn)動(dòng)的纖毛等[2-3]。其生活在淡水中，通常可以在有機(jī)質(zhì)豐富的河流、水塘中采集到它們，一般呈針尖狀發(fā)亮的白色點(diǎn)狀物浮動(dòng)在水中[4]。草履蟲適宜的生長(zhǎng)環(huán)境為25°C 左右，并且更喜歡生活在光線充足的水中，主要依靠取食水中的細(xì)菌和有機(jī)物來(lái)生存[1-4]。草履蟲的生殖方式主要為無(wú)性生殖和有性生殖，無(wú)性生殖即橫二分裂，有性生殖即接合生殖，它們繁殖快，生活周期較短為一周左右[5]。草履蟲的主要類別有大草履蟲、雙小核草履蟲、多小核草履蟲等。草履蟲有很多研究?jī)?yōu)點(diǎn)，如結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單便于觀察，生長(zhǎng)發(fā)育繁殖速度較快，易于在野外采集和便于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)等，所以草履蟲相關(guān)研究的應(yīng)用比較廣泛，例如可以用其凈化污水、作為研究細(xì)胞遺傳的材料從而在醫(yī)學(xué)方面起到診斷疾病的作用還有監(jiān)測(cè)水體的重金屬和農(nóng)藥含量等[2][6]。其在實(shí)驗(yàn)室中容易飼養(yǎng)，培養(yǎng)材料配制方法簡(jiǎn)易，通常使用的培養(yǎng)方法有稻草培養(yǎng)液培養(yǎng)法、麥粒培養(yǎng)液培養(yǎng)法、牛奶培養(yǎng)液培養(yǎng)法等[4]。

生物節(jié)律是指不論單細(xì)胞還是多細(xì)胞，動(dòng)物還是植物，所有生物在其生命過(guò)程中都會(huì)呈現(xiàn)一種周期性的有規(guī)律可循的活動(dòng)現(xiàn)象[7][8]。目前普遍認(rèn)為生物節(jié)律的影響因素有光照、溫度等條件[7][9][10]，已有研究表明高溫或者較高的重金屬離子濃度會(huì)影響生物體產(chǎn)生熱激蛋白進(jìn)行熱激反應(yīng)從而抵御外界環(huán)境的惡劣變化，熱激蛋白就是在動(dòng)植物體內(nèi)普遍存在的一種抗逆性蛋白，這種蛋白在動(dòng)植物熱激反應(yīng)過(guò)程中起著不可或缺的作用[11][12]。生物節(jié)律的研究具有十分重要的意義，如研究植物的生物節(jié)律可以使其在本不適宜其生存的地區(qū)生長(zhǎng)繁殖從而增加生物的多樣性，研究動(dòng)物的生物節(jié)律可以使其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)疾病方面的檢測(cè)和治療等[13][14][15]。

溫度是動(dòng)植物生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用的生長(zhǎng)因子，每種生物生長(zhǎng)繁殖時(shí)都需要一個(gè)較適宜的溫度來(lái)保證其生命活動(dòng)的正常進(jìn)行，溫度過(guò)低會(huì)使細(xì)胞凍傷從而損傷機(jī)體，溫度過(guò)高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活等[10]。已有研究表明不同溫度的環(huán)境會(huì)對(duì)草履蟲的增殖有不同的影響，如草履蟲最適宜的增殖溫度為2°C左右，溫度升高會(huì)促進(jìn)草履蟲的增殖，溫度的變化對(duì)草履蟲增殖的影響較為顯著等[16][17]。重金屬在空中、水體、土壤中都可廣泛存在，常見的重金屬有汞、鉛、鎘等，它們可對(duì)環(huán)境和動(dòng)植物造成極大的危害，重金屬污染是主要的污染類型之一[18]。重金屬沿著食物鏈不斷積累最終在人體內(nèi)匯集造成某些人體器官的衰竭[18]，重金屬會(huì)對(duì)微生物的結(jié)構(gòu)、種類等造成影響[19]，重金屬影響熱激蛋白和熱休克蛋白的表達(dá)等等[11][20]。其中的代表之一鎘離子對(duì)動(dòng)植物的危害除了體現(xiàn)在毒害作用以外，還可能導(dǎo)致生物重金屬積累導(dǎo)致慢性中毒、骨骼軟化和致癌性等方面[21][22][23]。

本實(shí)驗(yàn)欲通過(guò)不同溫度和金屬鎘離子對(duì)草履蟲增殖節(jié)律的影響，探究草履蟲的生物節(jié)律及其影響因素，為以后熱激蛋白的表達(dá)和生物節(jié)律的潛在關(guān)系探索基礎(chǔ)，對(duì)研究水體環(huán)境污染和污染物的監(jiān)測(cè)具有積極的意義，為今后對(duì)原生動(dòng)物生物節(jié)律的研究積累一些數(shù)據(jù)，從而為更多生物的生物節(jié)律研究奠定基礎(chǔ)，使各種生物與人類可以一起更好的生存發(fā)展，真正達(dá)到和諧共處的目的。

1 材料與方法

1.1 供試草履蟲。野生草履蟲取自天津師范大學(xué)湖泊水中。

1.2 草履蟲的純化。首先將采集到的湖泊水原液中的草履蟲與其他原生動(dòng)物進(jìn)行分離，方法是在陽(yáng)光充足的地方，用干凈透明的容器盛放湖泊水并觀察，靠近水面有針狀白色點(diǎn)狀物浮動(dòng)，用習(xí)慣吸取上層清液后置于離心管中，采用差速離心法在4000r/min 的條件下離心3min，用吸管吸取上層清液并保留離心管底部的沉淀物約1mL，得到草履蟲沉淀。

1.3 稻草培養(yǎng)液的制備。取干凈無(wú)污染的干稻草剪成3cm 長(zhǎng)的稻草段，按照其與蒸餾水為1g：1000mL 的比例進(jìn)行配置，將配置好的溶液進(jìn)行煮沸，10 分鐘后將溶液靜置于室溫下冷卻，冷卻至室溫后用雙層紗布密封容器并放置24h。

1.4 草履蟲的培養(yǎng)。將之前得到的草履蟲純化液與稻草培養(yǎng)液按1：10 的比例進(jìn)行混合，將混合液放置于溫度為20°C，光照條件12L：12D 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 天，每天都應(yīng)加入一定量的稻草培養(yǎng)液以補(bǔ)充草履蟲生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。7 天后觀察草履蟲的狀態(tài)，若其生長(zhǎng)狀況良好并且可以正常繁殖即可開始實(shí)驗(yàn)。

1.5 不同溫度對(duì)草履蟲增殖節(jié)律的影響

1.5.1 不同溫度下處理草履蟲 將已得到的草履蟲培養(yǎng)液和稻草培養(yǎng)液分別平均分為5 組，分別在室溫、26°C、30°C、33°C、37°C 下按照1：1 的比例進(jìn)行混合后置于對(duì)應(yīng)的溫度條件下飼養(yǎng)，以在室溫下培養(yǎng)的草履蟲為對(duì)照，首先在實(shí)驗(yàn)開始之前分別對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5.2 計(jì)數(shù)方法 在上午9:00 進(jìn)行第一次記數(shù)，將草履蟲混合液搖勻后用微量移液槍吸取2μL 混合液，之后用相應(yīng)溫度下的稻草培養(yǎng)液進(jìn)行等量液體補(bǔ)充，使混合培養(yǎng)液始終保持固定的量。將2μL 的混合培養(yǎng)液置于潔凈的載玻片上進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)，為防止草履蟲活動(dòng)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)，還需在載玻片上滴加1μL 5%的稀鹽酸溶液固定草履蟲方便進(jìn)行計(jì)數(shù)。按以上計(jì)數(shù)方法每4h 進(jìn)行一次計(jì)數(shù)，即13:00 與17:00 分別進(jìn)行第二、三次計(jì)數(shù)，為了保證數(shù)據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)從而減少誤差，每次計(jì)數(shù)應(yīng)重復(fù)進(jìn)行三次并計(jì)算平均值，實(shí)驗(yàn)一共進(jìn)行8h。

1.6 不同濃度的鎘離子溶液對(duì)草履蟲增殖節(jié)律的影響

1.6.1 不同濃度鎘離子處理草履蟲 首先配置濃度為0、10、20、30、40nmol/L 的鎘離子溶液，將草履蟲培養(yǎng)液和鎘離子溶液按1：1 的比例進(jìn)行混合后置于20°C、光周期為12L：12D 的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6.2 計(jì)數(shù)方法 見1.5.2，注意每次計(jì)數(shù)前都應(yīng)將混合培養(yǎng)液搖勻之后再取樣。計(jì)數(shù)結(jié)果分別見表1、表2。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析 主要使用SPSS19.9 軟件進(jìn)行方差分析，運(yùn)用的方法是Duncan 式新負(fù)極差法，顯著性為0.05。

2 結(jié)果與分析

表2

2.1 不同溫度對(duì)草履蟲增殖數(shù)量的影響見圖1、圖2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明前4 個(gè)小時(shí)內(nèi)草履蟲的數(shù)量在各個(gè)溫度條件下都有所下降，30°C 時(shí)數(shù)量下降最多，且在對(duì)照、26°C、37°C 條件下草履蟲的增殖數(shù)量沒(méi)有顯著性差異，這三組與30°C 和33°C條件下的草履蟲增殖數(shù)量有顯著性差異。后4 個(gè)小時(shí)內(nèi)在30°C 時(shí)草履蟲的數(shù)量顯著增多，其他溫度條件下草履蟲數(shù)量略微減少，且在對(duì)照、37°C 條件下草履蟲的增殖數(shù)量沒(méi)有顯著性差異，這兩組與26°C 、30°C 和33°C 條件下的草履蟲增殖數(shù)量有顯著性差異。

2.2 不同濃度的鎘離子對(duì)草履蟲增殖數(shù)量的影響見圖3、圖4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明前4 個(gè)小時(shí)內(nèi)草履蟲的數(shù)量在各個(gè)濃度鎘離子的條件下都有所下降，對(duì)照組下降最少，且隨著鎘離子濃度增加，草履蟲下降數(shù)量逐漸增多，鎘離子濃度為20、30nmol/L 時(shí)草履蟲增殖數(shù)量沒(méi)有顯著性差異，這兩組與對(duì)照、10 和40 nmol/L條件下的草履蟲增殖數(shù)量有顯著性差異。后4 個(gè)小時(shí)內(nèi)除了20nmol/L 以外的其他組中草履蟲數(shù)量有所上升，且實(shí)驗(yàn)組的草履蟲增殖數(shù)量都略低于對(duì)照組，鎘離子濃度為10、40nmol/L 時(shí)草履蟲增殖數(shù)量沒(méi)有顯著性差異，這兩組與對(duì)照、20 和30 nmol/L 條件下的草履蟲增殖數(shù)量有顯著性差異。

3 結(jié)論

圖1

圖2

在不同溫度條件下，從整體上看，草履蟲對(duì)溫度有一定程度的抗逆性，且這種抗逆性隨時(shí)間不斷提升，并且在9:00-17:00 之間，在不同溫度條件下，草履蟲有一定的增殖節(jié)律。溫度是影響生物體內(nèi)熱激蛋白含量的一個(gè)重要因素，在不同溫度下的熱激蛋白含量也會(huì)產(chǎn)生一定的變化。還有研究表明，在動(dòng)物體中存在著生物節(jié)律基因來(lái)調(diào)控生物節(jié)律的變化，我們可以推測(cè)出了依靠基因來(lái)表達(dá)熱激蛋白之外，熱激蛋白的表達(dá)或許還受到生物節(jié)律基因的調(diào)控[24]。

圖3

圖4

在不同濃度的鎘離子對(duì)草履蟲的增殖節(jié)律影響實(shí)驗(yàn)中，在9:00-13:00 時(shí)間段中草履蟲數(shù)量減少并且隨著鎘離子濃度增加，草履蟲死亡的數(shù)量也相應(yīng)增加，而在13:00-17:00 時(shí)間段中，草履蟲的數(shù)量有所上升，且在鎘離子濃度為30nmol/L 時(shí)草履蟲增殖量達(dá)到最高，或許是此濃度的鎘離子刺激其體內(nèi)表達(dá)了一定量的熱激蛋白從而對(duì)其自身起到了保護(hù)作用。這兩個(gè)時(shí)間段中草履蟲的增長(zhǎng)差異性側(cè)面證明了草履蟲對(duì)鎘離子的抗性差異或許與生物節(jié)律相關(guān)。有相關(guān)研究證明，草履蟲在12L：12D的光照條件下對(duì)鎘離子的抗性會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的生物節(jié)律變化，鎘離子在自然界的積累會(huì)使動(dòng)植物造成一定的毒害作用，從而間接影響生物的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖過(guò)程中的生理生化反應(yīng)。不過(guò)這種毒害作用也有反例，如在某些魚類、甲殼類生物的研究中發(fā)現(xiàn)一定量的重金屬離子可能會(huì)在某種程度上促進(jìn)這些生物的繁殖[25]。除了鎘離子之外還有許多重金屬都會(huì)對(duì)動(dòng)植物體內(nèi)的熱激蛋白的表達(dá)量有一定的影響，影響熱激蛋白表達(dá)的因素除了有重金屬、高溫以外還有低溫、饑餓、甚至包括過(guò)高的種群密度[26]。

結(jié)合Hinrichsen RD 在2008 年的研究報(bào)告，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究草履蟲的增殖情況來(lái)驗(yàn)證其體內(nèi)的熱激蛋白的表達(dá)有周期性的特點(diǎn)，這周周期性表達(dá)很有可能與生物節(jié)律基因的表達(dá)有關(guān)[26]。治療腫瘤的新型方法之一——熱化療法就是利用熱激蛋白的表達(dá)來(lái)提高免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性免疫作用，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[27][28]。但是溫度的升高和加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)對(duì)細(xì)胞有一定的損害作用，所以尋找最合適的條件是我們研究過(guò)程中的難題之一。本實(shí)驗(yàn)從溫度脅迫和毒脅迫兩個(gè)方面來(lái)驗(yàn)證草履蟲生物節(jié)律的變化，為以后研究熱激蛋白的表達(dá)和生物節(jié)律之間的潛在關(guān)系積累一定的數(shù)據(jù)，有助于人類關(guān)于腫瘤、癌癥等醫(yī)學(xué)方面的研究。