李月月，田曉清，韓清華，樊成奇，馬麗艷，陸亞男

（1.上海海洋大學(xué)，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

原甲藻（Prorocentrum）是導(dǎo)致赤潮的重要生物之一，其代表產(chǎn)物大田軟海綿酸（okadaic acid，OA）及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物鰭藻毒素-1（dinophysistoxin-1，DTX-1）是腹瀉性貝類(lèi)毒素（diarrheic shellfish poisoning，DSP）的主要組分。腹瀉性貝類(lèi)毒素引起的中毒事件具有全球性，自20世紀(jì)60年代以來(lái)在歐洲、亞洲、北美洲、南非等地都曾有報(bào)道［1］，DSP不僅會(huì)危害海洋生態(tài)平衡，還會(huì)通過(guò)海洋食物鏈的富集威脅人類(lèi)健康［2］，同時(shí)也是蛋白磷酸酶2A、1和2B的有效抑制劑，可以導(dǎo)致人體消化系統(tǒng)中癌癥的發(fā)生［3］。而利瑪原甲藻（P.lima）是原甲藻屬甲藻中主要的產(chǎn)毒藻株，可以作為腹瀉性貝毒的穩(wěn)定性來(lái)源，因此利瑪原甲藻在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)一直是人們研究的熱點(diǎn)。然而直到目前，對(duì)于利瑪原甲藻產(chǎn)毒機(jī)制方面的研究仍較少。事實(shí)上，利瑪原甲藻中生物毒素的表達(dá)水平受營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響很大［4］，但是包括環(huán)境微生物在內(nèi)的各種因素對(duì)其產(chǎn)毒的具體影響仍未有定論。雖然目前認(rèn)為利瑪原甲藻相關(guān)細(xì)菌并不能獨(dú)立產(chǎn)生毒素［5］，但是很多學(xué)者認(rèn)為其對(duì)藻毒素的產(chǎn)生有著直接或間接的影響［6］。有研究表明，細(xì)菌可能對(duì)利瑪原甲藻細(xì)胞產(chǎn)生毒素有一定的協(xié)同作用，在利瑪原甲藻的衰老階段，產(chǎn)毒水平增加，這些細(xì)菌可能開(kāi)始降解利瑪原甲藻細(xì)胞，會(huì)加速微藻的衰老，裂解作用可能會(huì)增加溶解有機(jī)碳的數(shù)量，這可能為增加毒素的產(chǎn)生提供更多的資源，從而促進(jìn)毒素的生成［1］。目前，關(guān)于細(xì)菌對(duì)利瑪原甲藻產(chǎn)毒的影響只進(jìn)行了初步的探索，它們之間的相互作用機(jī)制仍然需要更深入的研究。

本文以利瑪原甲藻藻株為研究材料，通過(guò)高通量測(cè)序及微生物純培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)利瑪原甲藻PL11可能的共附生菌群的多樣性進(jìn)行分析，包括其群落的組成以及相對(duì)豐度。并通過(guò)純培養(yǎng)的方法得到9株可培養(yǎng)細(xì)菌，以期為后期繼續(xù)研究細(xì)菌在微藻產(chǎn)毒過(guò)程中的作用提供必要的生物材料及基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生物材料：利瑪原甲藻PL11。

試劑材料：Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物有限公司）；16s引物（上海生工生物有限公司）；PCR擴(kuò)增體系（康為世紀(jì)）；PBS緩沖液（上海生工生物有限公司）。

培養(yǎng)基：f/2培養(yǎng)基，2216E培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)儀器：高壓滅菌鍋：股海申安醫(yī)療器械廠，LDZX-75KBS型；大型恒溫培養(yǎng)箱：上?；瘜W(xué)儀器有限公司，ATB-032型；超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司，DL-CJ-INDII型；臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司，H-1560型；超聲儀：上海漢克科學(xué)儀器有限公司，SK250LH型；PCR儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，AG-22331型；凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司，GIS-1600型。超純水儀：上海智巖科學(xué)儀器有限公司，Milli-QAdvantage型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻培養(yǎng)

利瑪原甲藻采用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。f/2培養(yǎng)基由4種儲(chǔ)備液配制而成，分別為75.0 g·L-1NaNO3溶液、5.0 g·L-1NaH2PO4·H2O溶液、L1 Trace Metal Solution和Vitamin Solution。其中 NaNO3溶液、NaH2PO4·H2O、L1 Trace Metal Solution以超純水配制后，高溫滅菌放入4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆茫籚itamin Solution以高溫滅菌后的超純水配制備用。L1 Trace Metal Solution和Vitamin Solution為混合溶液，具體配方見(jiàn)表1。

f/2培養(yǎng)基配制過(guò)程如下：將超純水用鹽鹵將其鹽度調(diào)至23，分別加入1 mL NaNO3溶液、NaH2PO4·H2O溶液以及L1 Trace Metal Solution，高壓滅菌鍋高溫滅菌30 min（120℃），冷卻至20℃加入0.5 mL Vitamin Solution。利瑪原甲藻的培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度為4 500～5 000 lx，光照周期為12L/12D，溫度為24℃。

表1 f/2培養(yǎng)基配方Tab.1 Medium formula of f/2

1.2.2 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)藻的密度達(dá)到1×106個(gè)·L-1后，取50 mL藻液于無(wú)菌離心管中，離心（轉(zhuǎn)速6 000 r·min-1，時(shí)間 5min），收集藻細(xì)胞，以 30 mL pH 7.2的PBS緩沖液洗滌藻細(xì)胞，重復(fù)4次放置備用。藻共附生菌總基因組DNA以Stool DNA Kit試劑盒（美國(guó)OMEGA）提取，取1mL以擴(kuò)增引物338F和806R進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物 為 806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′［7］。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：模板 DNA：10 ng，BSA：0.2μL，DNA多聚酶：0.4μL，5×FastPfu緩沖液：4μL，2.5 mmol·L-1dNTPs：2μL，上游引物（5μmol·L-1）：0.8μL，下游引物（5μmol·L-1）：0.8μL，加入滅菌后的超純水使總體積達(dá)到50μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性時(shí)間5 min（95℃），進(jìn)入循環(huán)，變性時(shí)間40 s（95℃），退火時(shí)間40 s（55℃），延伸時(shí)間60 s（72℃），循環(huán)30次，最后延伸15 min（72℃）。通過(guò)電泳來(lái)檢驗(yàn)PCR完成的產(chǎn)物是否合格，如條帶清晰，無(wú)降解則符合后續(xù)測(cè)序要求。如條帶不清晰或未出現(xiàn)，則重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若再次擴(kuò)增后仍沒(méi)出現(xiàn)清晰的條帶則要重新提取?；厥誔CR產(chǎn)物樣品進(jìn)行Illumina Miseq高通量測(cè)序（上海美吉生物公司）。

數(shù)據(jù)質(zhì)控：根據(jù)paired-end reads之間的互相重疊進(jìn)行序列拼接，對(duì)reads的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控分析［8］，具體操作如下：以 FLASH對(duì)每個(gè)樣品的讀長(zhǎng)進(jìn)行拼接，得到原始連接數(shù)據(jù)（raw tags），對(duì)原始連接數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的過(guò)濾以得到高質(zhì)量的連接數(shù)據(jù)（clean tags）；后續(xù)進(jìn)行tags截取，截取質(zhì)量閾值為≤19，堿基數(shù)默認(rèn)長(zhǎng)度為3，得到tags數(shù)據(jù)集，過(guò)濾掉連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于tags長(zhǎng)度75% 的 tags。最后進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，移除掉Chimera序列，得到有效數(shù)據(jù)（effective tags）［9］。

數(shù)據(jù)分析：按照序列間的距離進(jìn)行聚類(lèi)分析，從中選取與代表序列相似度大于97%的序列生成操作分類(lèi)單元（OTU）。選取Silva作為細(xì)菌16SrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、RDP、Greengene為功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Qiime平臺(tái)與 RDP Classifier分別作為計(jì)算軟件及算法，設(shè)定0.7為置信度閾值［10］。菌落豐富度（community richness）指數(shù)分別為Chao和ACE；菌落多樣性（community diversity）指數(shù)為Shannon以及 Simpson。稀釋曲線（rarefaction curve）采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們對(duì)應(yīng)的物種（如OTU）數(shù)目或多樣性指數(shù)來(lái)構(gòu)建。

1.2.3 可培養(yǎng)共附生菌株的分離及鑒定

取1.5 mL藻液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）于2 mL的EP管中，離心（轉(zhuǎn)速 6 000 r·min-1，5 min）。棄去上清液，加入1.5 mL無(wú)菌超純水輕輕震蕩混勻，重復(fù)離心一次，棄上清液加入1.5 mL無(wú)菌超純水震蕩混勻，冰浴下超聲波破碎藻細(xì)胞處理10 min，然后用滅菌超純水將其稀釋10倍，分別取200μL破碎藻細(xì)胞原液與稀釋后的藻液均勻的涂布在2216E平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，期間不斷進(jìn)行觀察，待培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出單菌落后，在2216E平板培養(yǎng)基上再次進(jìn)行劃線純化，徹底純化后的單菌落接種到固體斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h后接種到2216E液體培養(yǎng)基中并放入搖床中培養(yǎng)48 h（23℃）［10-11］。

16S rRNA測(cè)序及比對(duì)：使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（日本 TaKaRa）提取基因組DNA，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)步驟：取1 mL菌液至1.5 mL無(wú)菌離心管中，離心（轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1，時(shí)間 1 min），棄上清收集菌體。加入180μL溶菌酶溶液重懸菌液，37℃水浴30～60 min，再加入400μL Buffer Digestion，震蕩混勻，65℃水浴1 h。加入200μL Buffer PB，充分混勻，-20℃放置5 min后離心（轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，時(shí)間5 min），將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入1 mL異丙醇，充分混勻后離心（轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，時(shí)間 5 min），棄上清。加入 1 mL 75%乙醇，離心（轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，時(shí)間2 min），棄上清。打開(kāi)離心管的蓋子倒置5～10 min使乙醇完全揮發(fā)，得到所需DNA。加入50 μL TE Buffer溶解DNA，以16S rRNA擴(kuò)增通用引物27F及1492R進(jìn)行擴(kuò)增，其序列分別為上游引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增體系包括：23μL的 2×TaqPCR MasterMix：，1μL上游引物，1μL下游引物，5μL模板DNA，20μL去離子水［10］。PCR擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性時(shí)間4 min（95℃），進(jìn)入循環(huán)，變性時(shí)間40 s（95℃），退火時(shí)間40 s（57℃），延伸時(shí)間2 min（72℃），循環(huán) 40次，最后延伸 10 min（72℃）。PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳?；厥諛悠愤M(jìn)行基因測(cè)序（上海美吉生物公司），對(duì)獲得的16SrRNA基因序列進(jìn)行分析，通過(guò)EzBioCloud進(jìn)行菌株序列同源性對(duì)比，建立菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（MEGA軟件）［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品信息統(tǒng)計(jì)

利瑪原甲藻PL11共附生微生物的測(cè)序結(jié)果如表2所示，通過(guò)高通量測(cè)序一共獲得42 065條序列。稀釋曲線（rarefaction curve）可以用來(lái)比較測(cè)序樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性，也可以用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理［12］。以Shannon為多樣性指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線（圖1），樣品的曲線逐漸趨向水平，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量已經(jīng)足夠大，可以反映樣品中的物種多樣性，樣本的測(cè)序數(shù)量是合理的。

表2 利瑪原甲藻PL11共附生菌群高通量測(cè)序樣本信息表Tab.2 Summary of the high-throughput sequencing sample from P.lima PL11

圖1 利瑪原甲藻PL11共附生菌群高通量測(cè)序樣品Shannon-Wiener曲線Fig.1 Shannon-Wiener curve of the sequencing sample from P.lima PL11

2.2 利瑪原甲藻的共附生菌多樣性分析

MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果顯示，利瑪原甲藻PL11共附生菌群共68個(gè)OTU，包括5門(mén)，14綱，26目，38科及54屬。PL11共附生菌群屬水平相對(duì)豐度分布如圖2所示。其中優(yōu)勢(shì)門(mén)（＞5%）3個(gè)，包括變形菌門(mén)（Proteobacteria，75.5%）、擬桿菌門(mén)（Bacteriodetes，11.5%）以及浮霉菌門(mén)（Planctomycetex，8.5%）。優(yōu)勢(shì)綱（＞5%）4個(gè)，包括 α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，51.7%）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria，31.8%）、鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria，9.9%）以及 OM190綱（8.9%）；優(yōu)勢(shì)屬（＞5%）6個(gè)，包括侏囊菌科下未 知 屬 （norank Nannocystaceae，21.8%）、Pyruvatibacter屬（11.6%）、Phaeodactylibacter屬（9.4%）、生絲單胞菌科下未知屬（norank Hyphomonadaceae，8.5%）、OM190綱下未知屬（8.1%）以及Roseovarius屬（7.9%）。用MEGA6建立的利瑪原甲藻PL11共附生菌群系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖3。

2.3 利瑪原甲藻可培養(yǎng)共附生菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

從利瑪原甲藻PL11培養(yǎng)物中分離出了9株細(xì)菌，用MEGA6建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖4，通過(guò)序列同源性比對(duì)（表3）以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果顯示，這些菌株分屬于8個(gè)屬，如表3所示，分 別 為Ochrobactrumsp.（2株）及Microbacteriumsp.、Algoriphagussp.、Ponticoccussp.、Hoefleasp.、Labrenziasp.、Erythrobactersp.、Sphingopyxissp.各1株。其中，菌株P(guān)L11-1與已知菌株的16S rRNA基因同源性最高值為97.55%，說(shuō)明其為Ponticoccus屬潛在新種，其多相分類(lèi)學(xué)鑒定分析目前正在進(jìn)行中。

3 討論

圖3 利瑪原甲藻PL11共附生菌群系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial community associated with P.lima PL11

表3 菌株種屬的分類(lèi)結(jié)果Tab.3 Classification results of strain species

圖4 基于16Sr RNA序列構(gòu)建的可培養(yǎng)共附生菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on neighbor-joining analysis of 16S r RNA sequences

細(xì)菌和浮游植物之間的相互作用越來(lái)越多地被認(rèn)為是毒素產(chǎn)生和赤潮發(fā)生的重要因素［13］，了解毒素的產(chǎn)生機(jī)制有利用解決其對(duì)環(huán)境以及人類(lèi)健康產(chǎn)生的危害，藻菌之間的相互作用關(guān)系是了解毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高通量測(cè)序技術(shù)不經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)微生物就可以分析微生物群落的多樣性，從而為優(yōu)化利瑪原甲藻共附生微生物的分離并增加其可培養(yǎng)性帶來(lái)有價(jià)值的參考。本文利用MiSeq高通量測(cè)序首次對(duì)利瑪原甲藻PL11共附生菌群多樣性進(jìn)行了分析。從獲得的68個(gè)OTU中歸類(lèi)出54個(gè)屬，其優(yōu)勢(shì)屬6個(gè)。先前電子顯微鏡觀察研究表明，在無(wú)菌培養(yǎng)的利瑪原甲藻細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)菌。通過(guò)高通量測(cè)序可以清楚的看到利瑪原甲藻PL11具有豐富且多樣的微生物群落。

此外，基于微生物純培養(yǎng)技術(shù)從利瑪原甲藻PL11中分離獲得9株細(xì)菌，包括一株潛在新株P(guān)L11-1。PL11-1屬于玫瑰桿菌簇，紅桿菌科，Ponticoccus屬；Poncticoccussp.與藻類(lèi)赤潮爆發(fā)關(guān)系密切，TAN等［14］等發(fā)現(xiàn)Ponticoccus屬下一株菌在發(fā)生赤潮時(shí)能與藻類(lèi)相互作用，表現(xiàn)出一定的主導(dǎo)作用。Ponticoccussp.PD-2是首次發(fā)現(xiàn)的有群體感應(yīng)的菌株，它對(duì)多種赤潮藻的生長(zhǎng)都能產(chǎn)生抑制作用［15］。從利瑪原甲藻PL11中得到的PL11-1可能與利瑪原甲藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒都有著密切的關(guān)系。fan3-1屬于鞘氨醇單胞菌（Sphingopyxissp.），鞘氨醇單胞菌可以降解微囊藻毒素，通常情況下同一株菌只能降解一種藻毒素，Sphingopyxis屬下一株菌卻能夠同時(shí)降解 MCYR、MC-LR和 MC-RR 3種毒素［16］。進(jìn)一步研究Ponticoccus屬下PL11-1與Sphingopyxis屬下fan3-1和利瑪原甲藻之間的相互作用關(guān)系，可以更好地了解利瑪原甲藻產(chǎn)毒或毒素降解的機(jī)理。關(guān)于利瑪原甲藻與其共附生微生物的相互作用，本團(tuán)隊(duì)其他成員正在利用獲得的菌株開(kāi)展試驗(yàn)研究。

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)首次解析了利瑪原甲藻PL11共附生微生物種類(lèi)、豐度及多樣性信息，還通過(guò)分離純化獲得了純培養(yǎng)的PL11共附生細(xì)菌9株，對(duì)比發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)獲得的菌株種屬與高通量測(cè)序中相對(duì)豐度較高的種屬一致性不高，可能是菌株分離時(shí)的培養(yǎng)基、溫度等因素以及微生物自身的可培養(yǎng)性造成的影響。此結(jié)果對(duì)于深化對(duì)利瑪原甲藻共附生微生物多樣性的認(rèn)識(shí)，指導(dǎo)其可培養(yǎng)共附生微生物的分離具有重要意義。