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        氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

        2020-03-26 05:13:20熊大林段亞飛張家松陳成勛董宏標(biāo)劉青松
        海洋漁業(yè) 2020年1期
        關(guān)鍵詞:凡納濱對(duì)蝦氨氮

        熊大林,段亞飛,王 蕓,張家松,陳成勛,董宏標(biāo),李 華,劉青松

        (1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津 300384;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510300)

        凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對(duì)蝦,是我國重要的海水養(yǎng)殖蝦類[1]。然而,在對(duì)蝦集約化養(yǎng)殖模式中,養(yǎng)殖密度過高導(dǎo)致環(huán)境脅迫增加、病害頻發(fā),對(duì)蝦死亡率居高不下。養(yǎng)殖病害是病原、環(huán)境和動(dòng)物之間互作的結(jié)果,其中環(huán)境脅迫是主要的誘導(dǎo)因素[2]。氨氮是對(duì)蝦養(yǎng)殖中主要的環(huán)境脅迫因子,其主要是由對(duì)蝦殘餌、排泄物等含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生[3]。研究表明,高濃度的氨氮脅迫會(huì)造成對(duì)蝦抗病力降低、免疫力下降和病原易感性增加等,危害對(duì)蝦的存活和生長(zhǎng)[4-6]。

        近年來,對(duì)蝦腸道炎癥問題廣受關(guān)注。腸道是對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)和免疫的主要器官組織,其作為動(dòng)物消化道的主要屏障,能夠分隔腸腔內(nèi)物質(zhì),阻止病原微生物入侵機(jī)體[7]。此外,對(duì)蝦腸道內(nèi)棲息著大量的微生物菌群尤其是病原微生物,其同樣富含于對(duì)蝦養(yǎng)殖水環(huán)境中[8]。因此,對(duì)蝦腸道組織受到內(nèi)外環(huán)境的雙重影響,極易遭受環(huán)境脅迫而導(dǎo)致黏膜組織損傷和免疫功能紊亂,增加病原入侵機(jī)體的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。然而,作為對(duì)蝦高密度養(yǎng)殖條件下主要的水質(zhì)脅迫因子——氨氮,其對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦腸道免疫功能影響的研究尚未見報(bào)道。

        對(duì)蝦缺乏獲得性免疫系統(tǒng),主要依靠非特異性免疫因子抵抗病原感染和環(huán)境脅迫。酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)是動(dòng)物體內(nèi)參與免疫防御的重要水解酶[11]。溶菌酶(Lys)和酚氧化酶原(proPO)可作為衡量對(duì)蝦抗病原感染的功能指標(biāo)[11-12]。抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)和熱休克蛋白(HSPs)具有清除生物體內(nèi)活性氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的功能[9]。因此,本研究通過測(cè)定急性氨氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦腸道這幾種免疫生化指標(biāo)和基因表達(dá)量變化,旨在探討對(duì)蝦腸道組織應(yīng)答氨氮脅迫的免疫學(xué)特征,篩選其相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo),以期為其腸道健康研究提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        本研究所用健康凡納濱對(duì)蝦取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地,平均體質(zhì)量(5.4±0.3)g;于500 L玻璃纖維桶中暫養(yǎng)7 d,每桶50尾。實(shí)驗(yàn)期間,水溫30℃,鹽度30,pH 8.3,不間斷充氣,每天換水1/3,并投喂對(duì)蝦配合飼料。

        1.2 氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)

        將暫養(yǎng)7 d的對(duì)蝦隨機(jī)分為兩組,即:對(duì)照組和氨氮脅迫組,每組3個(gè)平行,每個(gè)平行50尾蝦。氨氮脅迫組的水體氨氮含量設(shè)定為20 mg·L-1,使用10 g·L-1的NH4Cl進(jìn)行調(diào)節(jié);每4 h使用靛酚藍(lán)分光光度法(GB 17378.4-2007)檢測(cè)水中氨氮濃度,并用NH4Cl溶液進(jìn)行調(diào)整;每天換水1/3,并加入相應(yīng)氨氮濃度的養(yǎng)殖海水。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)和暫養(yǎng)期間的養(yǎng)殖條件一致。分別于脅迫后的0、6、12、24、48和72 h,取對(duì)蝦中腸于液氮中冷凍保存。同一時(shí)間點(diǎn)每個(gè)平行組分別取6尾蝦的中腸,用鑷子輕輕刮去腸道內(nèi)容物,分別使用3尾用于生化指標(biāo)和基因表達(dá)分析。

        1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

        使用預(yù)冷的0.86%生理鹽水對(duì)所取的腸道組織進(jìn)行漂洗,去除組織液,濾紙拭干,稱重后置于離心管中。按照m(組織,g)∶V(生理鹽水,mL)=1∶9加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水,超聲粉碎制備組織勻漿液;然后于4℃、3 000 r·min-1離心10 min,取上清液于-80℃保存,用于生化指標(biāo)測(cè)定。

        使用南京建成生物工程研究所試劑盒分別測(cè)定 ACP、ALP、Lys、T-AOC和 SOD活性,以及組織蛋白含量,相關(guān)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定所用試劑盒均為同批次試劑??偟鞍缀康臏y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。ACP活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉法,以1 g組織蛋白與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)活力單位;ALP活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉法,以1 g組織蛋白與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位;Lys活性測(cè)定采用比濁法;1 mg組織蛋白與基質(zhì)作用1 min使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值增加0.01為1個(gè)T-AOC單位;SOD活性采用羥胺法,以1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的 SOD量為1個(gè)酶活力單位(U·mg-1)。

        1.4 免疫基因表達(dá)分析

        使用Trizol試劑提取氨氮脅迫后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)蝦腸道組織的總 RNA;使用核酸定量?jī)x(ThermoFisher,USA)檢測(cè)其純度和濃度,使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量及完整性。使用DNaseⅠ去除總RNA中多余的DNA,使用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,保存于-20℃下備用,具體操作按照說明書進(jìn)行。

        根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的凡納濱對(duì)蝦熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白 90(HSP90)、酚氧化酶原(proPO)基因和內(nèi)參基因β-actin的cDNA序列,使用Primer premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)正反特異性引物(表1),利用Real-time PCR對(duì)各組上述幾種基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品3個(gè)平行,按照 SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa,Beijing)試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL,包括10μL SYBR Premix ExTaqTMⅡ (2×),0.8 μL 10μmol·L-1正向引物,0.8μL 10μmol·L-1反向引物,0.4μL ROX Reference DyeⅡ (50×),2.0μL cDNA,6.0μL DEPC水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05表示差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫酶活性的影響

        與對(duì)照組相比,氨氮脅迫6 h,對(duì)蝦腸道ACP活性顯著升高(P<0.05);隨后逐漸降低,并于24~72 h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1-A)。ALP活性于氨氮脅迫6 h顯著升高(P<0.05),并于12 h達(dá)到最大值;隨后于48 h和72 h逐漸降低至顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1-B)。Lys活性于氨氮脅迫6 h顯著升高(P<0.05),隨后逐漸升高,并于24 h達(dá)到最大值;氨氮脅迫72 h,Lys活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1-C)。

        表1 本研究所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

        2.2 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道抗氧化酶活性的影響

        與對(duì)照組相比,對(duì)蝦腸道T-AOC活性于氨氮脅迫6 h顯著升高(P<0.05),并于12 h達(dá)到最大值;隨后于48 h和72 h顯著降低(P<0.05),并低于對(duì)照組水平(圖2-A)。SOD活性于氨氮脅迫6 h顯著升高至最大值(P<0.05),隨后逐漸降低,并于48 h和72 h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖2-B)。

        2.3 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫基因表達(dá)的影響

        與對(duì)照組相比,氨氮脅迫 6 h,對(duì)蝦腸道HSP70基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),并于24 h達(dá)到最大值;隨后表達(dá)水平雖有降低,但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3-A)。HSP90基因表達(dá)水平于氨氮脅迫后12 h顯著升高至最大值(P<0.05),隨后逐漸降低,并于48 h和72 h達(dá)到對(duì)照組水平(圖3-B)。proPO基因表達(dá)水平于氨氮脅迫6 h顯著升高(P<0.05),并于12 h達(dá)到最大值;隨后表達(dá)水平逐漸降低,并于72 h達(dá)到對(duì)照組水平(圖3-C)。

        圖1 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫酶活性的影響Fig.1 Immune enzyme activities in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

        圖2 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道抗氧化酶活性的影響Fig.2 Antioxidant enzyme activities in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

        圖3 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫基因表達(dá)的影響Fig.3 Immune gene expression in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

        3 討論

        對(duì)蝦主要依賴其非特異性免疫系統(tǒng)來抵御環(huán)境脅迫。研究表明,環(huán)境脅迫能夠損傷對(duì)蝦腸道黏膜組織,破壞腸道菌群的穩(wěn)定性,給條件致病菌創(chuàng)造入侵宿主機(jī)體的機(jī)會(huì)[9-10,12-13]。例如,凡納濱對(duì)蝦分別被氨氮和亞硝酸鹽脅迫72 h,腸道黏膜上皮細(xì)胞受損、脫落,黏液蛋白基因表達(dá)量紊亂,菌群多樣性降低、條件致病菌豐度增加[13]。此外,硫化物、脂多糖也會(huì)導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦腸道屏障功能受損[9-10,12]。因此,研究環(huán)境脅迫下對(duì)蝦腸道抗病原感染、抗氧化等免疫功能指標(biāo)變化,可以為其腸道損傷保護(hù)研究提供理論參考。

        ACP和ALP是兩種重要的溶酶體酶,屬于磷酸單酯水解酶類,其活性常用作蝦類非特異免疫功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)[14]。Lys作為對(duì)蝦機(jī)體中重要的抗菌蛋白,可以裂解細(xì)菌細(xì)胞,是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。proPO系統(tǒng)可以識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖、真菌的β-1,3-葡聚糖和革蘭氏陽性菌的肽聚糖等,是蝦類機(jī)體識(shí)別“非己”成分的免疫系統(tǒng)[16-17]。艾春香等[18]研究表明,氨氮脅迫導(dǎo)致擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)鰓和肝胰腺中ACP和AKP活性顯著下降。岳峰等[19]研究表明,氨氮脅迫導(dǎo)致三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血細(xì)胞proPO活性和溶菌活力顯著下降。本研究中,凡納濱對(duì)蝦被氨氮脅迫6 h和12 h,腸道ACP、ALP和Lys活性以及proPO基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),表明機(jī)體合成大量抗菌蛋白用于應(yīng)對(duì)氨氮脅迫的毒性作用;但是,氨氮脅迫72 h,ACP、ALP和 Lys活性顯著下降,表明氨氮脅迫對(duì)對(duì)蝦非特異性免疫功能造成了損傷,降低了其抗病原感染能力。

        當(dāng)動(dòng)物遭受環(huán)境脅迫時(shí),機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧(ROS),導(dǎo)致氧化損傷[20]。為維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài),蝦類體內(nèi)形成抗氧化防御系統(tǒng)包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng),而其功能狀況可以用T-AOC來衡量[11]。SOD在機(jī)體清除超氧陰離子(·O2-)過程中首先被誘導(dǎo),可將·O2-分解為H2O2和 O2,是抗氧化酶系統(tǒng)的標(biāo)志酶[9]。王蕓等[4]研究表明,中 國 明對(duì)蝦 (Fenneropenaeus chinensis)被 8 mg·L-1氨氮脅迫后6 h,其血淋巴中T-AOC活性顯著升高,隨后逐漸降低。任海等[21]研究表明,在不同濃度氨氮脅迫下,脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)血淋巴和肝胰腺中SOD活性隨氨氮濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),呈先上升后下降的趨勢(shì)。本研究中,氨氮脅迫6 h,凡納濱對(duì)蝦腸道T-AOC活性顯著升高(P<0.05),且SOD活性達(dá)到最大值,表明對(duì)蝦腸道抗氧化酶系統(tǒng)被激活用于清除機(jī)體集聚的ROS;但是氨氮脅迫48 h和72 h,T-AOC和SOD活性均顯著降低,表明氨氮脅迫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了過量ROS,超過了抗氧化酶的調(diào)節(jié)閾值,導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)受損。

        熱休克蛋白如HSP70和HSP90等,是生物體內(nèi)主要的應(yīng)激蛋白,其主要以“分子伴侶”形式修復(fù)機(jī)體受損的組織蛋白,在細(xì)胞保護(hù)、抗氧化等方面具有很重要作用[22]。HSPs表達(dá)量增加可以用于機(jī)體抵抗環(huán)境脅迫,提高動(dòng)物的抗應(yīng)激能力[23]。研究表明,機(jī)體HSP70與SOD基因的表達(dá)水平相一致,且HSP70直接增加機(jī)體內(nèi)源性過氧化物酶活性,用于降解 ROS[24]。王蕓等[25]研究表明,中國對(duì)蝦在氨氮脅迫下6~24 h,其機(jī)體HSP90基因表達(dá)量顯著上調(diào),隨后下降。本研究中,凡納濱對(duì)蝦腸道HSP70基因表達(dá)水平在氨氮脅迫72 h內(nèi)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),表明HSP70在對(duì)蝦腸道組織抵御氨氮脅迫進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。而HSP90基因在氨氮脅迫6~12 h顯著升高(P<0.05),隨后逐漸降至對(duì)照組水平,其與中國對(duì)蝦的研究結(jié)果相似,表明長(zhǎng)時(shí)間的氨氮脅迫造成腸道免疫功能受到抑制,從而導(dǎo)致HSP90基因表達(dá)水平下降。

        4 小結(jié)

        20 mg·L-1氨氮急性脅迫凡納濱對(duì)蝦72 h,對(duì)蝦腸道抗病原感染指標(biāo)(ACP、ALP、Lys和proPO),以及抗氧化功能指標(biāo)(T-AOC、SOD、HSP70、HSP90)發(fā)生顯著變化,表明氨氮脅迫造成對(duì)蝦腸道免疫功能紊亂。本研究所選的幾種免疫指標(biāo)對(duì)氨氮脅迫的反應(yīng)均較為敏感,可以作為對(duì)蝦腸道免疫損傷保護(hù)研究的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

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