熊大林，段亞飛，王 蕓，張家松，陳成勛，董宏標(biāo)，李 華，劉青松

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeusvannamei）又稱南美白對(duì)蝦，是我國重要的海水養(yǎng)殖蝦類［1］。然而，在對(duì)蝦集約化養(yǎng)殖模式中，養(yǎng)殖密度過高導(dǎo)致環(huán)境脅迫增加、病害頻發(fā)，對(duì)蝦死亡率居高不下。養(yǎng)殖病害是病原、環(huán)境和動(dòng)物之間互作的結(jié)果，其中環(huán)境脅迫是主要的誘導(dǎo)因素［2］。氨氮是對(duì)蝦養(yǎng)殖中主要的環(huán)境脅迫因子，其主要是由對(duì)蝦殘餌、排泄物等含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生［3］。研究表明，高濃度的氨氮脅迫會(huì)造成對(duì)蝦抗病力降低、免疫力下降和病原易感性增加等，危害對(duì)蝦的存活和生長(zhǎng)［4-6］。

近年來，對(duì)蝦腸道炎癥問題廣受關(guān)注。腸道是對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)和免疫的主要器官組織，其作為動(dòng)物消化道的主要屏障，能夠分隔腸腔內(nèi)物質(zhì)，阻止病原微生物入侵機(jī)體［7］。此外，對(duì)蝦腸道內(nèi)棲息著大量的微生物菌群尤其是病原微生物，其同樣富含于對(duì)蝦養(yǎng)殖水環(huán)境中［8］。因此，對(duì)蝦腸道組織受到內(nèi)外環(huán)境的雙重影響，極易遭受環(huán)境脅迫而導(dǎo)致黏膜組織損傷和免疫功能紊亂，增加病原入侵機(jī)體的風(fēng)險(xiǎn)［9-10］。然而，作為對(duì)蝦高密度養(yǎng)殖條件下主要的水質(zhì)脅迫因子——氨氮，其對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦腸道免疫功能影響的研究尚未見報(bào)道。

對(duì)蝦缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠非特異性免疫因子抵抗病原感染和環(huán)境脅迫。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）是動(dòng)物體內(nèi)參與免疫防御的重要水解酶［11］。溶菌酶（Lys）和酚氧化酶原（proPO）可作為衡量對(duì)蝦抗病原感染的功能指標(biāo)［11-12］。抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）和熱休克蛋白（HSPs）具有清除生物體內(nèi)活性氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的功能［9］。因此，本研究通過測(cè)定急性氨氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦腸道這幾種免疫生化指標(biāo)和基因表達(dá)量變化，旨在探討對(duì)蝦腸道組織應(yīng)答氨氮脅迫的免疫學(xué)特征，篩選其相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)，以期為其腸道健康研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用健康凡納濱對(duì)蝦取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，平均體質(zhì)量（5.4±0.3）g；于500 L玻璃纖維桶中暫養(yǎng)7 d，每桶50尾。實(shí)驗(yàn)期間，水溫30℃，鹽度30，pH 8.3，不間斷充氣，每天換水1/3，并投喂對(duì)蝦配合飼料。

1.2 氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)

將暫養(yǎng)7 d的對(duì)蝦隨機(jī)分為兩組，即：對(duì)照組和氨氮脅迫組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行50尾蝦。氨氮脅迫組的水體氨氮含量設(shè)定為20 mg·L-1，使用10 g·L-1的NH4Cl進(jìn)行調(diào)節(jié)；每4 h使用靛酚藍(lán)分光光度法（GB 17378.4-2007）檢測(cè)水中氨氮濃度，并用NH4Cl溶液進(jìn)行調(diào)整；每天換水1/3，并加入相應(yīng)氨氮濃度的養(yǎng)殖海水。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)和暫養(yǎng)期間的養(yǎng)殖條件一致。分別于脅迫后的0、6、12、24、48和72 h，取對(duì)蝦中腸于液氮中冷凍保存。同一時(shí)間點(diǎn)每個(gè)平行組分別取6尾蝦的中腸，用鑷子輕輕刮去腸道內(nèi)容物，分別使用3尾用于生化指標(biāo)和基因表達(dá)分析。

1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

使用預(yù)冷的0.86%生理鹽水對(duì)所取的腸道組織進(jìn)行漂洗，去除組織液，濾紙拭干，稱重后置于離心管中。按照m（組織，g）∶V（生理鹽水，mL）=1∶9加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水，超聲粉碎制備組織勻漿液；然后于4℃、3 000 r·min-1離心10 min，取上清液于-80℃保存，用于生化指標(biāo)測(cè)定。

使用南京建成生物工程研究所試劑盒分別測(cè)定 ACP、ALP、Lys、T-AOC和 SOD活性，以及組織蛋白含量，相關(guān)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定所用試劑盒均為同批次試劑?？偟鞍缀康臏y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。ACP活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉法，以1 g組織蛋白與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)活力單位；ALP活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉法，以1 g組織蛋白與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位；Lys活性測(cè)定采用比濁法；1 mg組織蛋白與基質(zhì)作用1 min使反應(yīng)體系的吸光度（OD）值增加0.01為1個(gè)T-AOC單位；SOD活性采用羥胺法，以1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的 SOD量為1個(gè)酶活力單位（U·mg-1）。

1.4 免疫基因表達(dá)分析

使用Trizol試劑提取氨氮脅迫后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)蝦腸道組織的總 RNA；使用核酸定量?jī)x（ThermoFisher，USA）檢測(cè)其純度和濃度，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量及完整性。使用DNaseⅠ去除總RNA中多余的DNA，使用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃下備用，具體操作按照說明書進(jìn)行。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的凡納濱對(duì)蝦熱休克蛋白70（HSP70）、熱休克蛋白 90（HSP90）、酚氧化酶原（proPO）基因和內(nèi)參基因β-actin的cDNA序列，使用Primer premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)正反特異性引物（表1），利用Real-time PCR對(duì)各組上述幾種基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品3個(gè)平行，按照 SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TaKaRa，Beijing）試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL，包括10μL SYBR Premix ExTaqTMⅡ （2×），0.8 μL 10μmol·L-1正向引物，0.8μL 10μmol·L-1反向引物，0.4μL ROX Reference DyeⅡ （50×），2.0μL cDNA，6.0μL DEPC水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫酶活性的影響

與對(duì)照組相比，氨氮脅迫6 h，對(duì)蝦腸道ACP活性顯著升高（P＜0.05）；隨后逐漸降低，并于24～72 h顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖1-A）。ALP活性于氨氮脅迫6 h顯著升高（P＜0.05），并于12 h達(dá)到最大值；隨后于48 h和72 h逐漸降低至顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖1-B）。Lys活性于氨氮脅迫6 h顯著升高（P＜0.05），隨后逐漸升高，并于24 h達(dá)到最大值；氨氮脅迫72 h，Lys活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖1-C）。

表1 本研究所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

2.2 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道抗氧化酶活性的影響

與對(duì)照組相比，對(duì)蝦腸道T-AOC活性于氨氮脅迫6 h顯著升高（P＜0.05），并于12 h達(dá)到最大值；隨后于48 h和72 h顯著降低（P＜0.05），并低于對(duì)照組水平（圖2-A）。SOD活性于氨氮脅迫6 h顯著升高至最大值（P＜0.05），隨后逐漸降低，并于48 h和72 h顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖2-B）。

2.3 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，氨氮脅迫 6 h，對(duì)蝦腸道HSP70基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），并于24 h達(dá)到最大值；隨后表達(dá)水平雖有降低，但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖3-A）。HSP90基因表達(dá)水平于氨氮脅迫后12 h顯著升高至最大值（P＜0.05），隨后逐漸降低，并于48 h和72 h達(dá)到對(duì)照組水平（圖3-B）。proPO基因表達(dá)水平于氨氮脅迫6 h顯著升高（P＜0.05），并于12 h達(dá)到最大值；隨后表達(dá)水平逐漸降低，并于72 h達(dá)到對(duì)照組水平（圖3-C）。

圖1 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫酶活性的影響Fig.1 Immune enzyme activities in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

圖2 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道抗氧化酶活性的影響Fig.2 Antioxidant enzyme activities in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

圖3 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道免疫基因表達(dá)的影響Fig.3 Immune gene expression in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

3 討論

對(duì)蝦主要依賴其非特異性免疫系統(tǒng)來抵御環(huán)境脅迫。研究表明，環(huán)境脅迫能夠損傷對(duì)蝦腸道黏膜組織，破壞腸道菌群的穩(wěn)定性，給條件致病菌創(chuàng)造入侵宿主機(jī)體的機(jī)會(huì)［9-10，12-13］。例如，凡納濱對(duì)蝦分別被氨氮和亞硝酸鹽脅迫72 h，腸道黏膜上皮細(xì)胞受損、脫落，黏液蛋白基因表達(dá)量紊亂，菌群多樣性降低、條件致病菌豐度增加［13］。此外，硫化物、脂多糖也會(huì)導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦腸道屏障功能受損［9-10，12］。因此，研究環(huán)境脅迫下對(duì)蝦腸道抗病原感染、抗氧化等免疫功能指標(biāo)變化，可以為其腸道損傷保護(hù)研究提供理論參考。

ACP和ALP是兩種重要的溶酶體酶，屬于磷酸單酯水解酶類，其活性常用作蝦類非特異免疫功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)［14］。Lys作為對(duì)蝦機(jī)體中重要的抗菌蛋白，可以裂解細(xì)菌細(xì)胞，是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)［15］。proPO系統(tǒng)可以識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖、真菌的β-1，3-葡聚糖和革蘭氏陽性菌的肽聚糖等，是蝦類機(jī)體識(shí)別“非己”成分的免疫系統(tǒng)［16-17］。艾春香等［18］研究表明，氨氮脅迫導(dǎo)致擬穴青蟹（Scyllaparamamosain）鰓和肝胰腺中ACP和AKP活性顯著下降。岳峰等［19］研究表明，氨氮脅迫導(dǎo)致三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血細(xì)胞proPO活性和溶菌活力顯著下降。本研究中，凡納濱對(duì)蝦被氨氮脅迫6 h和12 h，腸道ACP、ALP和Lys活性以及proPO基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），表明機(jī)體合成大量抗菌蛋白用于應(yīng)對(duì)氨氮脅迫的毒性作用；但是，氨氮脅迫72 h，ACP、ALP和 Lys活性顯著下降，表明氨氮脅迫對(duì)對(duì)蝦非特異性免疫功能造成了損傷，降低了其抗病原感染能力。

當(dāng)動(dòng)物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧（ROS），導(dǎo)致氧化損傷［20］。為維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，蝦類體內(nèi)形成抗氧化防御系統(tǒng)包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，而其功能狀況可以用T-AOC來衡量［11］。SOD在機(jī)體清除超氧陰離子（·O2-）過程中首先被誘導(dǎo)，可將·O2-分解為H2O2和 O2，是抗氧化酶系統(tǒng)的標(biāo)志酶［9］。王蕓等［4］研究表明，中 國 明對(duì)蝦 （Fenneropenaeus chinensis）被 8 mg·L-1氨氮脅迫后6 h，其血淋巴中T-AOC活性顯著升高，隨后逐漸降低。任海等［21］研究表明，在不同濃度氨氮脅迫下，脊尾白蝦（Exopalaemoncarinicauda）血淋巴和肝胰腺中SOD活性隨氨氮濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，呈先上升后下降的趨勢(shì)。本研究中，氨氮脅迫6 h，凡納濱對(duì)蝦腸道T-AOC活性顯著升高（P＜0.05），且SOD活性達(dá)到最大值，表明對(duì)蝦腸道抗氧化酶系統(tǒng)被激活用于清除機(jī)體集聚的ROS；但是氨氮脅迫48 h和72 h，T-AOC和SOD活性均顯著降低，表明氨氮脅迫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了過量ROS，超過了抗氧化酶的調(diào)節(jié)閾值，導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)受損。

熱休克蛋白如HSP70和HSP90等，是生物體內(nèi)主要的應(yīng)激蛋白，其主要以“分子伴侶”形式修復(fù)機(jī)體受損的組織蛋白，在細(xì)胞保護(hù)、抗氧化等方面具有很重要作用［22］。HSPs表達(dá)量增加可以用于機(jī)體抵抗環(huán)境脅迫，提高動(dòng)物的抗應(yīng)激能力［23］。研究表明，機(jī)體HSP70與SOD基因的表達(dá)水平相一致，且HSP70直接增加機(jī)體內(nèi)源性過氧化物酶活性，用于降解 ROS［24］。王蕓等［25］研究表明，中國對(duì)蝦在氨氮脅迫下6～24 h，其機(jī)體HSP90基因表達(dá)量顯著上調(diào)，隨后下降。本研究中，凡納濱對(duì)蝦腸道HSP70基因表達(dá)水平在氨氮脅迫72 h內(nèi)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明HSP70在對(duì)蝦腸道組織抵御氨氮脅迫進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。而HSP90基因在氨氮脅迫6～12 h顯著升高（P＜0.05），隨后逐漸降至對(duì)照組水平，其與中國對(duì)蝦的研究結(jié)果相似，表明長(zhǎng)時(shí)間的氨氮脅迫造成腸道免疫功能受到抑制，從而導(dǎo)致HSP90基因表達(dá)水平下降。

4 小結(jié)

20 mg·L-1氨氮急性脅迫凡納濱對(duì)蝦72 h，對(duì)蝦腸道抗病原感染指標(biāo)（ACP、ALP、Lys和proPO），以及抗氧化功能指標(biāo)（T-AOC、SOD、HSP70、HSP90）發(fā)生顯著變化，表明氨氮脅迫造成對(duì)蝦腸道免疫功能紊亂。本研究所選的幾種免疫指標(biāo)對(duì)氨氮脅迫的反應(yīng)均較為敏感，可以作為對(duì)蝦腸道免疫損傷保護(hù)研究的評(píng)價(jià)指標(biāo)。