董小鵬， 王麗娟， 趙春霖， 張建平， 潘海邦， 易劍鋒， 石育弘

1 甘肅中醫(yī)藥大學 a.臨床醫(yī)學院； b.藥學院，蘭州 730000； 2 甘肅省中藥藥理與毒理重點實驗室， 蘭州 730000；3 甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 普外科， 蘭州 730020

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由多種病因引起的以胰酶激活和胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征的一種常見外科急腹癥。一般情況下，AP發(fā)病較急且進展迅速，一部分患者可出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征，進而發(fā)展為重癥AP，其病死率高達15%～40%[1]。因此，AP治療的關(guān)鍵時機是發(fā)病后的48～72 h內(nèi)，否則病情加重，臨床病程延長，不僅增加醫(yī)療成本負擔且病死率也進一步升高[2]。目前國內(nèi)外多項研究[3-4]結(jié)果表明，炎癥反應(yīng)與AP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但具體機制迄今尚未完全闡明。近年來，中藥及其有效成分對于多種疾病的防治普遍受到關(guān)注，在AP中也有報道[5-6]。據(jù)此，本研究利用生物信息學方法從高通量數(shù)據(jù)庫中挖掘出在AP中可能發(fā)揮重要作用的基因，為后續(xù)機制研究提供線索。同時，圍繞這些基因從藥物數(shù)據(jù)庫中篩選出具有潛在治療價值的中藥及其有效成分，以期為AP的治療提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 材料 在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus database，GEO)[7](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=)中搜索AP相關(guān)的數(shù)據(jù)集，研究類型限定為“基因表達譜芯片”，從中選擇Norberg等[8]2018年提交的GSE109227數(shù)據(jù)集及Kong等2015年提交的GSE65146數(shù)據(jù)集。這兩個數(shù)據(jù)集均以腹腔注射雨蛙肽方法制備小鼠AP模型。GSE109227數(shù)據(jù)集(平臺：GPL6246)有11個樣本：5個正常樣本(樣本編號：GSM2935589～GSM2935593)，6個疾病樣本(樣本編號：GSM1588094～GSM1588099)。GSE65146(平臺：GPL6246)共73個樣本，根據(jù)研究者設(shè)計方案及本研究要求選擇其中8個樣本：5個正常樣本(樣本編號：GSM1588086～GSM1588090)，3個疾病樣本(樣本編號：GSM2935594～GSM2935599)。

1.2 方法

1.2.1 基因表達譜芯片差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)篩選 使用在線工具GEO2R對GSE109227和GSE65146數(shù)據(jù)集分別進行DEGs篩選。刪去數(shù)據(jù)集中沒有注釋的探針及同時對應(yīng)多個基因的探針，若多個探針對應(yīng)同一個基因取最大值。GSE109227數(shù)據(jù)集的篩選標準：adjP<0.01且|log FC|≥1.5；GSE65146數(shù)據(jù)集的篩選標準：adjP<0.05且|log FC|≥2。篩選出的DEGs取交集。

1.2.2 對DEGs進行GO功能富集和KEGG通路富集分析 使用DAVID(the database for annotation,visualization,and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫[9](https://david.ncifcrf.gov/)對篩選出來的DEGs分別進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。GO富集分析有分為三個方面，分別是：分子功能(molecular function，MF)、生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cell component，CC)。

1.2.3 對DEGs進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 String(the search tool for the retrieval of interacting genes)數(shù)據(jù)庫[10](https://string-db.org/)和Cytooscape軟件[11]是用來構(gòu)建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的主要工具。首先使用STRING11.0對DEGs構(gòu)建蛋白互作關(guān)系對，選取combined score>0.4(中等可信度)的蛋白互作關(guān)系對導入Cytoscape 3.7.0 軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，選擇節(jié)點度(degree)≥12的DEGs作為關(guān)鍵基因，并使用MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行子網(wǎng)絡(luò)模塊分析。

1.2.4 在ToppGene數(shù)據(jù)庫檢索DEGs相關(guān)miRNA DEGs在體內(nèi)表達水平發(fā)生異常變化可能是疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。在真核生物體內(nèi)，基因表達水平主要受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA可通過靶向mRNA的3′UTR區(qū)抑制mRNA翻譯或使其發(fā)生降解從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。在ToppGene數(shù)據(jù)庫[12](https://toppgene.cchmc.org/)檢索靶向關(guān)鍵基因的miRNA。參數(shù)設(shè)定值：(1)Correction，F(xiàn)DR；(2)P-Value cut off，0.05；(3)Gene Limts，1≤n≤2000；(4)Source，miRTarbase。

1.2.5 比較毒物遺傳學數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database，CTD)篩選關(guān)鍵基因的候選藥物 CTD數(shù)據(jù)庫[13](http://ctdbase.org/)整合了多種生物的重要數(shù)據(jù)，可提供關(guān)于基因與化合物之間相互作用的信息，是進行藥物篩選的重要工具。在CTD數(shù)據(jù)庫中，導入關(guān)鍵基因篩選出對這些關(guān)鍵基因具有潛在作用的化合物作為AP的潛在治療藥物。

2 結(jié)果

2.1 高通量芯片DEGs篩選結(jié)果 GEO2R篩選結(jié)果顯示：GSE109227數(shù)據(jù)集中共篩選出655個DEGs，其中上調(diào)基因551個，下調(diào)基因104個。GSE65146數(shù)據(jù)集中篩選到673個DEGs，其中上調(diào)591個，下調(diào)82個。利用熱圖可直觀顯示出兩個數(shù)據(jù)集中DEGs表達水平變化主要以上調(diào)為主(圖1)。將兩個數(shù)據(jù)集的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別取交集，共獲得130個共同上調(diào)基因，16個共同下調(diào)基因，且DEGs的上下調(diào)方向在兩個數(shù)據(jù)集完全一致。

2.2 DEGs GO功能富集和KEGG通路富集分析結(jié)果 利用DAVID對DEGs相關(guān)的MF、BP、CC進行分析，結(jié)果顯示：DEGs主要參與炎癥反應(yīng)和中性粒細胞趨化、血小板聚集、細胞黏附、促進基因表達等過程，共有51個條目；DEGs主要存在于細胞表面、細胞外間隙、細胞質(zhì)膜外側(cè)等，共53個條目；在MF方面，DEGs主要與蛋白或蛋白復合物結(jié)合、與細胞黏附分子結(jié)合等，共有24個條目。KEGG通路富集結(jié)果顯示，DEGs主要參與細胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控、白細胞內(nèi)皮遷移、Focal adhesion等18條通路。GO和KEGG富集分析顯著性排名前10的條目見圖2。

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)可視化 本研究利用DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，共有12個DEGs的degree≥18，分別是：Fn1、Cd44、Itgam、Cdh1、Cd68、Anxa2、Vcl、Lgals3、Kras、Cd14、Timp1、Anxa5，提示這些基因可能在AP發(fā)病過程中具有更重要的作用(圖3)。此外，對該網(wǎng)絡(luò)進行子網(wǎng)絡(luò)模塊構(gòu)建，篩選出6個具有統(tǒng)計學差異的模塊，顯著性最高的模塊見圖4，該模塊中有16個基因，其中Cd44、Itgam、Vcl、Kras、Fn1 及Lgals3也屬于篩選出的關(guān)鍵基因。

2.4 與關(guān)鍵基因相關(guān)的miRNA預(yù)測分析 PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選的關(guān)鍵基因均屬于上調(diào)基因，可能是AP發(fā)病的致病因素。利用生物信息學方法預(yù)測到這些基因有30個miRNAs，這些miRNAs通過作用于不同關(guān)鍵基因的3′UTR區(qū)產(chǎn)生負調(diào)控作用。其中顯著性最高的前5個miRNA見表1。

注：a，GSE109227數(shù)據(jù)集；b，GSE65146數(shù)據(jù)集。紅色表示上調(diào)基因，藍色表示下調(diào)基因。

注：a,MF富集;b,BP富集;c,CC富集;d,KEGG通路富集。

圖3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵基因

圖4PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的子網(wǎng)絡(luò)模塊

表1 關(guān)鍵基因相關(guān)miRNA預(yù)測結(jié)果

2.5 AP治療的候選藥物篩選結(jié)果 在CTD藥物數(shù)據(jù)庫中檢索能夠減少關(guān)鍵基因表達的藥物,即可能對AP具有潛在治療效果的藥物，根據(jù)每個藥物對應(yīng)關(guān)鍵基因數(shù)目的多少進行排序，前3種植物藥分別是染料木黃酮、白藜蘆醇、植物提取物(表2)。

3 討論

多項研究[14-15]表明除了胰腺微循環(huán)障礙、胰腺腺泡細胞凋亡、高脂血癥等因素外，過度的全身炎癥反應(yīng)在AP的發(fā)生發(fā)展中起到了極其重要的作用。具體來說，在AP發(fā)病的初始階段，主要表現(xiàn)為炎癥細胞被激活，產(chǎn)生大量的炎癥因子如TNFα、IL-6等從而引發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng)。隨著炎癥反應(yīng)的不斷放大，大量釋放的炎癥因子還可損傷除胰腺以外的遠隔臟器如肺臟、肝臟、腎臟、腦、腎上腺等重要器官，出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征，并可演變成為多器官功能障礙綜合征，最終導致患者死亡[16-18]。此外，也有研究[19]發(fā)現(xiàn)自噬參與AP 發(fā)病過程，這可能與胰腺內(nèi)胰酶異常激活與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，但具體機制不明。

近年來，隨著基因芯片和二代測序等多種高通量生物技術(shù)而發(fā)展起來的生物信息學受到普遍關(guān)注。生物信息學方法的優(yōu)點在于其將醫(yī)學、統(tǒng)計學、計算機等學科結(jié)合在一起對檢測數(shù)據(jù)進行分析并可根據(jù)位點關(guān)系等進行多種機制預(yù)測，利用該方法對研究者自己的高通量數(shù)據(jù)或者GEO、TCGA等公共數(shù)據(jù)庫存儲的高通量數(shù)據(jù)進行檢索、比較和分析，可以較全面的探索疾病發(fā)生發(fā)展的機制及篩選新的治療藥物。但同時也要認識到生物信息學技術(shù)僅側(cè)重于生物數(shù)據(jù)的篩選和計算，其分析結(jié)果不能完全代表生物體內(nèi)的真實情況，具有一定局限性。因此，利用生物信息學方法分析高通量數(shù)據(jù)的同時需結(jié)合相應(yīng)的基礎(chǔ)實驗研究和臨床研究進行驗證，這樣才能深入探索疾病發(fā)病機制并指導臨床治療。在一些研究中利用生物信息學方法篩選得到的疾病靶點在臨床樣本中已得到了證實，同時，針對這些疾病靶點利用生物信息學方法還可篩選新的治療藥物，并在動物實驗中也進行了相應(yīng)的驗證[20-21]。但新藥的研發(fā)是一個嚴格的過程，所以目前利用生物信息學方法篩選出來的治療藥物暫未見有臨床應(yīng)用的報道。

本研究結(jié)果顯示，從GEO數(shù)據(jù)庫的GSE109227和GSE65146兩個數(shù)據(jù)集中共篩選到146個DEGs，其中130個DEGs表達水平發(fā)生上調(diào)。對其進行功能富集分析，結(jié)果提示DEGs主要參與炎癥反應(yīng)、中性粒細胞趨化、TNF介導的細胞反應(yīng)、正調(diào)控基因表達等生物學過程，這與前述的炎癥反應(yīng)可介導AP發(fā)病相吻合。通路富集結(jié)果表明DEGs主要集中在ECM受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控、白細胞內(nèi)皮遷移、Focal adhesion等信號通路。Awla等[22]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶可有效激活胰腺腺泡細胞中胰蛋白酶原繼而調(diào)節(jié)AP的病理炎癥和組織損傷，而通常認為基質(zhì)金屬蛋白酶可以調(diào)節(jié)胰蛋白酶原的降解和ECM重塑，本研究富集到的ECM受體相關(guān)信號通路在AP發(fā)病機制中尚未見報道，這為今后機制研究提供了新的線索。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，利用節(jié)點度對DEGs進一步篩選從中找到更有研究價值的關(guān)鍵基因如Fn1、Cd44、Itgam等，同時還篩選出6個子網(wǎng)絡(luò)模塊。同一模塊中的蛋白質(zhì)之間具有較強的功能相關(guān)性，可能協(xié)同作用參與AP發(fā)病。DEGs的表達水平可能會受到多層次調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是真核生物基因表達水平發(fā)生改變的重要環(huán)節(jié)，而miRNAs可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)影響基因表達水平[23-24]。針對PPI中的關(guān)鍵基因篩選出hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-1-3p等miRNAs。同時，針對這些關(guān)鍵基因，利用生物信息學方法篩選出染料木黃酮、白藜蘆醇、槲皮素等中藥有效成分可能對AP具有一定治療作用。其中，白藜蘆醇和槲皮素對于胰腺炎的治療已有實驗研究報道。研究[25-26]表明，白藜蘆醇單獨使用可通過減少炎性細胞因子的過度釋放對重癥AP大鼠產(chǎn)生一定保護作用，也可以與其他藥物如或大黃素聯(lián)用治療AP大鼠。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，可減輕高甘油三酯相關(guān)AP大鼠的胰腺病理損傷[27-28]。

綜上所述，本研究利用生物信息學方法篩選出AP發(fā)病過程中的重要靶點基因及潛在的治療藥物，但后續(xù)尚需進行相關(guān)實驗研究進行證實，以便為AP的發(fā)病機制探討及臨床治療提供更多依據(jù)。

表2 CTD數(shù)據(jù)庫篩選的候選藥物