董小鵬， 王麗娟， 趙春霖， 張建平， 潘海邦， 易劍鋒， 石育弘

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) a.臨床醫(yī)學(xué)院； b.藥學(xué)院，蘭州 730000； 2 甘肅省中藥藥理與毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000；3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科， 蘭州 730020

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由多種病因引起的以胰酶激活和胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征的一種常見外科急腹癥。一般情況下，AP發(fā)病較急且進(jìn)展迅速，一部分患者可出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征，進(jìn)而發(fā)展為重癥AP，其病死率高達(dá)15%～40%[1]。因此，AP治療的關(guān)鍵時(shí)機(jī)是發(fā)病后的48～72 h內(nèi)，否則病情加重，臨床病程延長，不僅增加醫(yī)療成本負(fù)擔(dān)且病死率也進(jìn)一步升高[2]。目前國內(nèi)外多項(xiàng)研究[3-4]結(jié)果表明，炎癥反應(yīng)與AP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但具體機(jī)制迄今尚未完全闡明。近年來，中藥及其有效成分對于多種疾病的防治普遍受到關(guān)注，在AP中也有報(bào)道[5-6]。據(jù)此，本研究利用生物信息學(xué)方法從高通量數(shù)據(jù)庫中挖掘出在AP中可能發(fā)揮重要作用的基因，為后續(xù)機(jī)制研究提供線索。同時(shí)，圍繞這些基因從藥物數(shù)據(jù)庫中篩選出具有潛在治療價(jià)值的中藥及其有效成分，以期為AP的治療提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 材料 在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus database，GEO)[7](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=)中搜索AP相關(guān)的數(shù)據(jù)集，研究類型限定為“基因表達(dá)譜芯片”，從中選擇Norberg等[8]2018年提交的GSE109227數(shù)據(jù)集及Kong等2015年提交的GSE65146數(shù)據(jù)集。這兩個(gè)數(shù)據(jù)集均以腹腔注射雨蛙肽方法制備小鼠AP模型。GSE109227數(shù)據(jù)集(平臺：GPL6246)有11個(gè)樣本：5個(gè)正常樣本(樣本編號：GSM2935589～GSM2935593)，6個(gè)疾病樣本(樣本編號：GSM1588094～GSM1588099)。GSE65146(平臺：GPL6246)共73個(gè)樣本，根據(jù)研究者設(shè)計(jì)方案及本研究要求選擇其中8個(gè)樣本：5個(gè)正常樣本(樣本編號：GSM1588086～GSM1588090)，3個(gè)疾病樣本(樣本編號：GSM2935594～GSM2935599)。

1.2 方法

1.2.1 基因表達(dá)譜芯片差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)篩選 使用在線工具GEO2R對GSE109227和GSE65146數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行DEGs篩選。刪去數(shù)據(jù)集中沒有注釋的探針及同時(shí)對應(yīng)多個(gè)基因的探針，若多個(gè)探針對應(yīng)同一個(gè)基因取最大值。GSE109227數(shù)據(jù)集的篩選標(biāo)準(zhǔn)：adjP<0.01且|log FC|≥1.5；GSE65146數(shù)據(jù)集的篩選標(biāo)準(zhǔn)：adjP<0.05且|log FC|≥2。篩選出的DEGs取交集。

1.2.2 對DEGs進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析 使用DAVID(the database for annotation,visualization,and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫[9](https://david.ncifcrf.gov/)對篩選出來的DEGs分別進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO富集分析有分為三個(gè)方面，分別是：分子功能(molecular function，MF)、生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cell component，CC)。

1.2.3 對DEGs進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 String(the search tool for the retrieval of interacting genes)數(shù)據(jù)庫[10](https://string-db.org/)和Cytooscape軟件[11]是用來構(gòu)建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的主要工具。首先使用STRING11.0對DEGs構(gòu)建蛋白互作關(guān)系對，選取combined score>0.4(中等可信度)的蛋白互作關(guān)系對導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，選擇節(jié)點(diǎn)度(degree)≥12的DEGs作為關(guān)鍵基因，并使用MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)模塊分析。

1.2.4 在ToppGene數(shù)據(jù)庫檢索DEGs相關(guān)miRNA DEGs在體內(nèi)表達(dá)水平發(fā)生異常變化可能是疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。在真核生物體內(nèi)，基因表達(dá)水平主要受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA可通過靶向mRNA的3′UTR區(qū)抑制mRNA翻譯或使其發(fā)生降解從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。在ToppGene數(shù)據(jù)庫[12](https://toppgene.cchmc.org/)檢索靶向關(guān)鍵基因的miRNA。參數(shù)設(shè)定值：(1)Correction，F(xiàn)DR；(2)P-Value cut off，0.05；(3)Gene Limts，1≤n≤2000；(4)Source，miRTarbase。

1.2.5 比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database，CTD)篩選關(guān)鍵基因的候選藥物 CTD數(shù)據(jù)庫[13](http://ctdbase.org/)整合了多種生物的重要數(shù)據(jù)，可提供關(guān)于基因與化合物之間相互作用的信息，是進(jìn)行藥物篩選的重要工具。在CTD數(shù)據(jù)庫中，導(dǎo)入關(guān)鍵基因篩選出對這些關(guān)鍵基因具有潛在作用的化合物作為AP的潛在治療藥物。

2 結(jié)果

2.1 高通量芯片DEGs篩選結(jié)果 GEO2R篩選結(jié)果顯示：GSE109227數(shù)據(jù)集中共篩選出655個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因551個(gè)，下調(diào)基因104個(gè)。GSE65146數(shù)據(jù)集中篩選到673個(gè)DEGs，其中上調(diào)591個(gè)，下調(diào)82個(gè)。利用熱圖可直觀顯示出兩個(gè)數(shù)據(jù)集中DEGs表達(dá)水平變化主要以上調(diào)為主(圖1)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)集的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別取交集，共獲得130個(gè)共同上調(diào)基因，16個(gè)共同下調(diào)基因，且DEGs的上下調(diào)方向在兩個(gè)數(shù)據(jù)集完全一致。

2.2 DEGs GO功能富集和KEGG通路富集分析結(jié)果 利用DAVID對DEGs相關(guān)的MF、BP、CC進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：DEGs主要參與炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞趨化、血小板聚集、細(xì)胞黏附、促進(jìn)基因表達(dá)等過程，共有51個(gè)條目；DEGs主要存在于細(xì)胞表面、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)等，共53個(gè)條目；在MF方面，DEGs主要與蛋白或蛋白復(fù)合物結(jié)合、與細(xì)胞黏附分子結(jié)合等，共有24個(gè)條目。KEGG通路富集結(jié)果顯示，DEGs主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控、白細(xì)胞內(nèi)皮遷移、Focal adhesion等18條通路。GO和KEGG富集分析顯著性排名前10的條目見圖2。

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)可視化 本研究利用DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，共有12個(gè)DEGs的degree≥18，分別是：Fn1、Cd44、Itgam、Cdh1、Cd68、Anxa2、Vcl、Lgals3、Kras、Cd14、Timp1、Anxa5，提示這些基因可能在AP發(fā)病過程中具有更重要的作用(圖3)。此外，對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)模塊構(gòu)建，篩選出6個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的模塊，顯著性最高的模塊見圖4，該模塊中有16個(gè)基因，其中Cd44、Itgam、Vcl、Kras、Fn1 及Lgals3也屬于篩選出的關(guān)鍵基因。

2.4 與關(guān)鍵基因相關(guān)的miRNA預(yù)測分析 PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選的關(guān)鍵基因均屬于上調(diào)基因，可能是AP發(fā)病的致病因素。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測到這些基因有30個(gè)miRNAs，這些miRNAs通過作用于不同關(guān)鍵基因的3′UTR區(qū)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。其中顯著性最高的前5個(gè)miRNA見表1。

注：a，GSE109227數(shù)據(jù)集；b，GSE65146數(shù)據(jù)集。紅色表示上調(diào)基因，藍(lán)色表示下調(diào)基因。

注：a,MF富集;b,BP富集;c,CC富集;d,KEGG通路富集。

圖3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵基因

圖4PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的子網(wǎng)絡(luò)模塊

表1 關(guān)鍵基因相關(guān)miRNA預(yù)測結(jié)果

2.5 AP治療的候選藥物篩選結(jié)果 在CTD藥物數(shù)據(jù)庫中檢索能夠減少關(guān)鍵基因表達(dá)的藥物,即可能對AP具有潛在治療效果的藥物，根據(jù)每個(gè)藥物對應(yīng)關(guān)鍵基因數(shù)目的多少進(jìn)行排序，前3種植物藥分別是染料木黃酮、白藜蘆醇、植物提取物(表2)。

3 討論

多項(xiàng)研究[14-15]表明除了胰腺微循環(huán)障礙、胰腺腺泡細(xì)胞凋亡、高脂血癥等因素外，過度的全身炎癥反應(yīng)在AP的發(fā)生發(fā)展中起到了極其重要的作用。具體來說，在AP發(fā)病的初始階段，主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量的炎癥因子如TNFα、IL-6等從而引發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng)。隨著炎癥反應(yīng)的不斷放大，大量釋放的炎癥因子還可損傷除胰腺以外的遠(yuǎn)隔臟器如肺臟、肝臟、腎臟、腦、腎上腺等重要器官，出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征，并可演變成為多器官功能障礙綜合征，最終導(dǎo)致患者死亡[16-18]。此外，也有研究[19]發(fā)現(xiàn)自噬參與AP 發(fā)病過程，這可能與胰腺內(nèi)胰酶異常激活與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，但具體機(jī)制不明。

近年來，隨著基因芯片和二代測序等多種高通量生物技術(shù)而發(fā)展起來的生物信息學(xué)受到普遍關(guān)注。生物信息學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)在于其將醫(yī)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)等學(xué)科結(jié)合在一起對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并可根據(jù)位點(diǎn)關(guān)系等進(jìn)行多種機(jī)制預(yù)測，利用該方法對研究者自己的高通量數(shù)據(jù)或者GEO、TCGA等公共數(shù)據(jù)庫存儲的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索、比較和分析，可以較全面的探索疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及篩選新的治療藥物。但同時(shí)也要認(rèn)識到生物信息學(xué)技術(shù)僅側(cè)重于生物數(shù)據(jù)的篩選和計(jì)算，其分析結(jié)果不能完全代表生物體內(nèi)的真實(shí)情況，具有一定局限性。因此，利用生物信息學(xué)方法分析高通量數(shù)據(jù)的同時(shí)需結(jié)合相應(yīng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證，這樣才能深入探索疾病發(fā)病機(jī)制并指導(dǎo)臨床治療。在一些研究中利用生物信息學(xué)方法篩選得到的疾病靶點(diǎn)在臨床樣本中已得到了證實(shí)，同時(shí)，針對這些疾病靶點(diǎn)利用生物信息學(xué)方法還可篩選新的治療藥物，并在動物實(shí)驗(yàn)中也進(jìn)行了相應(yīng)的驗(yàn)證[20-21]。但新藥的研發(fā)是一個(gè)嚴(yán)格的過程，所以目前利用生物信息學(xué)方法篩選出來的治療藥物暫未見有臨床應(yīng)用的報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，從GEO數(shù)據(jù)庫的GSE109227和GSE65146兩個(gè)數(shù)據(jù)集中共篩選到146個(gè)DEGs，其中130個(gè)DEGs表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)。對其進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果提示DEGs主要參與炎癥反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化、TNF介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)、正調(diào)控基因表達(dá)等生物學(xué)過程，這與前述的炎癥反應(yīng)可介導(dǎo)AP發(fā)病相吻合。通路富集結(jié)果表明DEGs主要集中在ECM受體相互作用、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控、白細(xì)胞內(nèi)皮遷移、Focal adhesion等信號通路。Awla等[22]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶可有效激活胰腺腺泡細(xì)胞中胰蛋白酶原繼而調(diào)節(jié)AP的病理炎癥和組織損傷，而通常認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶可以調(diào)節(jié)胰蛋白酶原的降解和ECM重塑，本研究富集到的ECM受體相關(guān)信號通路在AP發(fā)病機(jī)制中尚未見報(bào)道，這為今后機(jī)制研究提供了新的線索。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，利用節(jié)點(diǎn)度對DEGs進(jìn)一步篩選從中找到更有研究價(jià)值的關(guān)鍵基因如Fn1、Cd44、Itgam等，同時(shí)還篩選出6個(gè)子網(wǎng)絡(luò)模塊。同一模塊中的蛋白質(zhì)之間具有較強(qiáng)的功能相關(guān)性，可能協(xié)同作用參與AP發(fā)病。DEGs的表達(dá)水平可能會受到多層次調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是真核生物基因表達(dá)水平發(fā)生改變的重要環(huán)節(jié)，而miRNAs可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)影響基因表達(dá)水平[23-24]。針對PPI中的關(guān)鍵基因篩選出hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-1-3p等miRNAs。同時(shí)，針對這些關(guān)鍵基因，利用生物信息學(xué)方法篩選出染料木黃酮、白藜蘆醇、槲皮素等中藥有效成分可能對AP具有一定治療作用。其中，白藜蘆醇和槲皮素對于胰腺炎的治療已有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。研究[25-26]表明，白藜蘆醇單獨(dú)使用可通過減少炎性細(xì)胞因子的過度釋放對重癥AP大鼠產(chǎn)生一定保護(hù)作用，也可以與其他藥物如或大黃素聯(lián)用治療AP大鼠。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，可減輕高甘油三酯相關(guān)AP大鼠的胰腺病理損傷[27-28]。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法篩選出AP發(fā)病過程中的重要靶點(diǎn)基因及潛在的治療藥物，但后續(xù)尚需進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行證實(shí)，以便為AP的發(fā)病機(jī)制探討及臨床治療提供更多依據(jù)。

表2 CTD數(shù)據(jù)庫篩選的候選藥物