任 姍， 杜曉菲， 黃云麗， 黃春洋， 張曉丹， 單 晶， 陳新月

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 肝病免疫科， 北京 100069

由于藥物、保健品的頻繁使用及環(huán)境毒物等多種因素的影響，藥物性肝損傷(DILI)發(fā)病率呈逐年上升趨勢，部分患者病情反復，起病即出現重癥化趨勢，是近年來急性肝衰竭的主要原因之一[1]。越來越多數據證實DILI與人類白細胞抗原(HLA)Ⅰ、Ⅱ類基因遺傳多態(tài)性相關，表明適應性免疫在DILI中發(fā)揮重要作用[2-6]。γ干擾素誘導蛋白-10(interferon γ-induced protein 10,IP-10)作為趨化因子(CXC)家族中一員，與其受體CXCR3相互作用，趨化及激活T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷(natural killer，NK)細胞，發(fā)揮抗感染、抑制病毒等多種生物學功能。近年來有研究[7-8]顯示IP-10參與了狼瘡腎炎、自身免疫性肝炎等多種自身免疫性疾病進展，但在DILI中的表達少有研究。本研究通過檢測血清IP-10水平及其基因多態(tài)性，探討IP-10聯合宿主單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)對DILI伴自身免疫現象的鑒別意義，旨在為DILI的診斷、預防及治療提供新的依據和思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2016年10月至2019年6月于本院肝病免疫科診治的DILI患者168例作為研究對象，DILI診斷標準采用2015年中華醫(yī)學會肝病學分會《藥物性肝損傷診治指南》[9]推薦的RUCAM 量表：超過8分為高度可能；6～8分為可能性大；3～5分為可能；1～2分為不太可能，等于或小于0分除外診斷；本研究納入評分≥6分的患者。排除標準：(1)合并病毒性肝炎(包括HAV、HBV、HCV、HEV、巨細胞病毒、EB病毒)和HIV等感染；(2)合并自身免疫性、遺傳代謝性、脂肪性或酒精性肝?。?3)合并惡性腫瘤；(4)靜脈藥癮者；(5)合并風濕性疾病、內分泌及代謝性疾病；(6)4周內使用過糖皮質激素或其他免疫抑制劑者。本研究方案得到首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批號：LL-2018-131-K)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料采集及標本收集 收集患者臨床資料，包括一般情況、合并用藥、主要癥狀和體征、實驗室檢查、治療方案、臨床轉歸等。所有入組患者均于治療基線留取全血、血清，于-80 ℃保存以備檢測SNP及IP-10水平。

1.3 病例分組 DILI伴自身免疫現象組，即AI-DILI組，依據自身免疫性肝炎(AIH)簡化診斷標準[10-12]，選取分數4～6分的患者[包括抗核抗體(ANA)/抗平滑肌抗體(SMA)/抗肝腎微粒體抗體(抗LKM)-1陽性或IgG升高或病理提示界面炎]；非AI-DILI組為分數<4分。

AIH簡化診斷標準參考國際自身免疫性肝炎小組( IAIHG) 2008年AIH 簡化積分系統(tǒng)：自身抗體、血清 IgG 水平、肝臟組織學變和排除病毒性肝炎四個項目進行評分，每個項目最高計2分，共計8分：6～7分為“可能”的AIH，>7分可確診AIH。

1.4 檢測方法

1.4.1 實驗室檢測 血清生化學指標： ALT、AST、ALP、TBil、DBil、GGT、Alb、總蛋白(TP)采用OLMPUS-AU5400生化檢測儀；免疫學指標：血清IgG 和IgM采用美國 Beckman coulter Array 360 全自動特種蛋白分析儀檢測。自身免疫性肝病相關抗體:ANA、SMA、抗LKM、抗線粒體抗體(AMA)、抗可溶性肝抗原抗體/抗肝-胰抗體(SLA/LP)、抗SP100和抗gp210采用ELISA及免疫印跡法(試劑購自德國歐蒙醫(yī)學實驗診斷有限公司)。

1.4.2 IP-10及SNP檢測 血清IP-10水平檢測：采用液相芯片技術(Luminex技術)，Bio-Plex 200 system(美國Bio-Rad公司)。IP-10(rs56061981位點)SNP分型：TaqMan探針基因分型，上?；倒緳z測(羅氏LightCycler480實時熒光定量PCR儀，LCS480 1.5.1.62軟件進行基因分型)。

1.4.3 超聲引導下肝穿刺活組織檢查 超聲引導下肝穿刺活組織檢查患者102例：B 超引導下MAGNUM活檢系統(tǒng)(Bard Peripheral Vascular, Inc, 美國)經皮穿刺取肝組織，穿刺肝組織長度>1.0 cm；10%中性福爾馬林液固定標本及石蠟包埋。4 μm 連續(xù)切片，分別做HE、Masso三色、Gomori網織纖維和D-PAS染色。

2 結果

2.1 一般資料 168例DILI患者中男56例，女112例；年齡19～70歲，平均(47.3±12.5)歲。其中AI-DILI組72例，男22例，女50例；年齡19～69歲，平均(48.0±12.0)歲。非AI-DILI組96例，男34 例，女62例；年齡22～70 歲，平均(50.6±11.2)歲，兩組患者在年齡、性別構成比上差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。用藥情況分析：患者中應用中草藥/中成藥及膳食補充劑74例(44.05%)，其中應用較多的有治療皮膚病、骨科疾病藥物及染發(fā)劑、膳食補充劑。應用解熱鎮(zhèn)痛藥28例(16.67%)，抗微生物藥21例(12.50%)，降脂藥16例(9.52%)，調節(jié)血糖藥11例(6.55%)，抗腫瘤藥(化療藥及靶向藥)8例(4.76%)，廣譜抗病毒藥6例(3.57%)，抗癲癇藥4例(2.38%)。

2.2 AI-DILI組與非AI-DILI組臨床指標比較 兩組間AST及IgG水平差異均存在統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。在自身抗體檢測方面：AI-DILI組自身抗體陽性有66例(91.67%)，依據發(fā)生比例的高低分別是ANA、SMA、ACA、SSA/SSB、細胞骨架抗體、APCA。非AI-DILI組合并自身抗體陽性12例(12.5%)，兩組之間合并自身抗體陽性的比例存在顯著差異 (χ2=103.8，P<0.05)。168例患者中有64例(AI-DILI組38例，非AI-DILI組26例)為重度肝損傷[TBil≥5×ULN(85.5 μmol/L)，伴或不伴 INR≥ 1.5]，其余均為輕度及中度肝損傷，均予以保肝支持治療。重度肝損傷患者應用甲強龍的劑量為(0.65± 0.15)mg·kg-1·d-1，屬于中小劑量，激素應用后首次調整劑量時間(減量或停用)為(8.0±4.1)d，其中直接停用28例，逐漸減量36例[應用時間<1月(短療程)21例，3月內(中療程)15例]。所有患者隨訪時間為3～17個月，62例(36.9%)患者出現病情反復(ALT或TBil波動)，但其AIH 簡易評分均未達到 AIH 的診斷標準。

表1 AI-DILI組與非AI-DILI組血清生化學指標及免疫指標

2.3 IP-10基因多態(tài)性(rs56061981)與DILI臨床轉歸的相關性 IP-10基因rs56061981位點基因型頻率與人種關系并不顯著(依據NCBI官方SNP數據)：C等位基因在非洲人群比例略低，其余如亞洲人群或歐洲人群比例較高(86.38% vs 93.33%,P=0.07)。本研究顯示，CC基因型在DILI患者中的分布頻率與一般人群[13]相當(69.05% vs 78.89%，P=0.43),而且攜帶C等位基因也在二者間大致相同(78.57% vs 88.98%，P=0.25)(表2)。這提示IP-10基因多態(tài)性似乎并不能影響DILI的易感性以及人群的分布差異性。

AI-DILI組的患者CC基因型頻率顯著高于非AI-DILI組(χ2=4.592，P=0.03)，同時AI-DILI組攜帶C等位基因頻率顯著高于非AI-DILI組(χ2=4.41，P=0.04)(表2)。

2.4 DILI治療過程中血清IP-10表達的變化 AI-DILI患者基線IP-10水平顯著高于非AI-DILI患者[(627.99±198.07] pg/ml vs (378.13±218.45) pg/ml，t=7.34,P<0.05](圖1a)，且與基線AST水平及AIH評分呈正相關(r值分別為0.67、0.79，P值均<0.05)。

隨著治療進展，所有患者2周時IP-10水平逐漸下降，4周時IP-10水平顯著下降，12周及治療結束時IP-10水平相接近，整體的變化趨勢差異有統(tǒng)計學意義(F=6.305，P<0.05)(圖1b)；分組分析顯示其變化趨勢在AI-DILI組更為明顯(F=9.42，P<0.05)，與基線比較治療2周時AI-DILI組水平顯著下降[(627.99±198.07) pg/ml vs (423.14±221.65) pg/ml，t=7.62，P=0.04)，繼續(xù)治療至4周IP-10水平降至(311.23±171.90)pg/ml，12周及治療結束時分別為(230.73 ±128.26)pg/ml和(208.33±68.95)pg/ml(圖1c)；非AI-DILI組的變化趨勢無顯著差異(F=1.07，P=0.23)(圖1d)。

表2 IP-10 rs56061981基因型及等位基因在不同組間的分布頻率

注：a，2組患者IP-10水平比較；b，所有患者IP-10變化；

2.5 基線血清IP-10的水平預測AI-DILI 基于ROC曲線進一步分析基線IP-10水平對DILI伴自免現象的預測作用，結果顯示，基線IP-10預測AI-DILI的ROC曲線下面積為0.832，敏感度、特異度分別為0.846、0.867，最佳閾值為527.03 pg/ml(圖2)。

2.6 血清IP-10水平聯合IP-10基因多態(tài)性預測AI-DILIIP-10 rs56061981位點CC基因型在AI-DILI組分布頻率顯著高于非AI-DILI組，故進一步分析IP-10 CC基因型及血清IP-10變化聯合預測DILI伴自身免疫現象。在IP-10 CC基因型的116例患者中，基線IP-10水平<527.03 pg/ml的患者有51例(43.97%)，≥527.03 pg/ml的患者65例(56.03%)，而在52例CT/TT基因型患者中，<527.03 pg/ml的患者有32例(61.54%)，≥527.03 pg/ml的患者20例(38.46%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.89，P=0.03)(圖3a)。而且，CC基因型患者中基線IP-10水平≥527.03 pg/ml的有80%(52/65)為AI-DILI，基線IP-10水平<527.03 pg/ml的患者有7.8%(4/51)為AI-DILI；而在CT/TT基因型患者中基線IP-10水平≥527.03 pg/ml的患者僅有50%(10/20)為AI-DILI，基線IP-10水平<527.03 pg/ml的有31.25%(6/32)為AI-DILI，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為13.28、59.80，P值分別為0.006、<0.01)(圖3b)。聯合CC基因型及基線IP-10≥527.03 pg/ml，預測AI-DILI發(fā)生的陽性預測值為92.84%，陰性預測值為86.33%。

圖3 IP-10基因多態(tài)性(rs56061981)結合基線IP-10水平

3 討論

2010年Russmann等[14]研究顯示，宿主遺傳易感背景以及適應性免疫在DILI的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用，提示炎性細胞因子的釋放及相互作用貫穿于整個DILI發(fā)生、發(fā)展的全過程，在免疫應答中發(fā)揮了關鍵作用，主要包括IL、干擾素及趨化因子等。而IP-10作為CXC趨化因子家族中重要的炎癥因子，能夠特異性活化表達CXCR3的相關細胞，誘導細胞毒性T淋巴細胞的活化，并與干擾素相互協同，在各種肝臟疾病中發(fā)揮促炎作用，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎以及刀豆蛋白A誘導的DILI[15]。而宿主基因多態(tài)性現象，尤其是基因啟動子區(qū)的SNP可以影響細胞因子的表達，從而使宿主對抗原免疫反應的強度存在一定差異。通過細胞因子發(fā)揮免疫效能是宿主免疫系統(tǒng)執(zhí)行效應的主要方式，故選擇宿主目的基因時，宿主基因多態(tài)性的不同需要進一步結合其下游抗病毒蛋白或者細胞因子表達差異進行綜合分析[16-18]。

首先，本研究顯示IP-10 SNP的確會影響IP-10血清水平表達差異：IP-10基因rs56061981位點CC基因型患者其基線IP-10表達顯著高于非CC基因型，這與最近研究[19-20]結果一致，IP-10啟動子區(qū)rs56061981位點的突變改變了核內蛋白的親和力進而調節(jié)IP-10的表達，將增強IP-10的轉錄和肝臟炎癥反應，使男性慢性乙型肝炎患者干擾素治療效果提高，出現HBeAg及HBsAg滴度下降，將是一個新的潛在性的SNP位點。其次，本研究顯示IP-10基因rs56061981位點CC基因型在AI-DILI組的分布頻率顯著高于非AI-DILI組。第三，本研究也顯示AI-DILI組患者IP-10水平顯著高于非AI-DILI組，隨著治療的進行，DILI患者血清IP-10水平總的變化趨勢為：2周時IP-10水平開始下降，4周時明顯低于基線水平，12周及治療結束時IP-10水平相接近；進一步依據分組分析顯示，該變化趨勢在AI-DILI組更為顯著，而非AI-DILI組各治療時間點IP-10變化不具備統(tǒng)計學差異。

基于上述相關性，將宿主IP-10基因多態(tài)性結合其細胞因子表達水平共同來預測DILI伴自身免疫現象的發(fā)生。CC基因型患者中基線IP-10水平≥527.03 pg/ml有80%(52/65)為AI-DILI，CC基因型聯合基線IP-10≥527.03 pg/ml預測AI-DILI的效能顯著提高。迄今為止，IP-10 SNP是否確定影響血清IP-10水平的表達，二者是否與AI-DILI易感性有關鮮有報道，本研究顯示這二者與AI-DILI的發(fā)生密切相關。Xie等[21]研究也提示IP-10血清表達水平與DILI的嚴重程度顯著相關，并依據該指標建立模型對DILI嚴重程度進行預測。另外，也有研究[22]顯示，IP-10還可用于預測急性HIV感染時CD4+T淋巴細胞下降趨勢以及疾病的進展，而IP-10 rs56061981位點可作為潛在保護性SNP位點預測肺結核患者疾病嚴重程度，聯合IP-10 水平其預測價值更為顯著[23]。

當AI-DILI與AIH鑒別診斷存在困難時,可使用糖皮質激素,觀察對激素的應答效果,前者應答更快,需要的劑量也較小,最為重要的是停用糖皮質激素不會出現病情的反復,而后者停用激素會出現病情反復。故在臨床表現及病理學上鑒別診斷存在困難時，治療后隨訪是鑒別的重要手段。本研究隨訪時間為3～17個月，但還需要長期隨訪進行驗證。

綜上所述，本研究證實了IP-10在鑒別診斷DILI伴自身免疫現象的臨床意義，同時IP-10基因多態(tài)性將影響血清IP-10水平的表達，二者聯合預測AI-DILI的效能顯著提高。除了聯合宿主基因多態(tài)性及其下游編碼的蛋白表達水平共同預測以外，筆者將在之后的AI-DILI發(fā)病機制研究中論證作為效應細胞因子，IP-10聯合干擾素γ影響CD4+輔助性T淋巴細胞1的功能。