陸 謙， 程 欣， 夏振國， 陳 鐘

1 南通大學附屬醫(yī)院 肝膽外科， 江蘇 南通 226001； 2 南通市通州區(qū)人民醫(yī)院 普外科， 江蘇 南通 226300

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是最常見的肝臟惡性腫瘤。據(jù)最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國男女患者的肝癌發(fā)病率均位居全球首位[1-2]。研究[3]證實肝癌的發(fā)生是一個多基因參與、多步驟改變的復雜過程，而目前對肝癌發(fā)生發(fā)展的精確分子機制仍不完全清楚。蛋白酶體是一種多亞基復合物，可選擇性地降解80%～90%的細胞內蛋白，并參與幾乎所有的細胞過程[4]。蛋白酶體β亞基4型(PSMB4)被鑒定為第一個具有致癌特性的蛋白酶體亞基，可以促進體內癌細胞的存活和腫瘤生長[5]。目前，PSMB4對人類肝癌細胞的功能影響尚不清楚。本研究擬通過短發(fā)夾RNA技術(shRNA)探討PSMB4對肝癌SMMC7721細胞增殖存活的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SMMC7721細胞株購自上海吉凱生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；0.25%的胰蛋白酶購自美國Thermo公司；兔抗人PSMB4單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG抗體、細胞裂解液購自美國Abcam公司；蛋白marker，轉印濾紙、PVDF膜、磷酸鹽緩沖液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒，Western Blot試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒，MTT試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購自江蘇碧云天公司。本研究方案經(jīng)由南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批(批號：2018-L006)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代 細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清以及1%雙抗(青鏈霉素混合液)的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱。待細胞生長至80%～90%時，吸凈培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液清洗，0.25%胰酶消化，加培養(yǎng)液吹打均勻成細胞懸液，按1∶2的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PSMB4干擾序列及細胞轉染 3個干擾PSMB4特異性shRNA載體及一個空shRNA載體由上海吉凱生物科技有限公司合成，其3個序列分別為shRNA1-GTTGAAATAGAGGGACCAT、shRNA2-CGAGTCAACAACAGTACCA、shRNA3-GGTGATTGATGAGGAGCTT。細胞培養(yǎng)至80%～90%時，加入用培養(yǎng)基稀釋的shRNA載體及轉染試劑Lipofectamine 2000，輕輕吹打混勻，培養(yǎng)48 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 平板克隆實驗 將轉染后的細胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔1000個細胞，設置3個復孔，培養(yǎng)至絕大多數(shù)單個克隆中細胞數(shù)大于50時，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛，固定30 min，加入潔凈、無雜質GIEMSA染液500 μl，靜置15 min，數(shù)碼相機拍照，統(tǒng)計克隆計數(shù)。

1.2.4 MTT測定 在96孔板中加入轉染后的細胞懸液，每孔2000個細胞，設置3個復孔，鋪板5張，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在第2、3、4、5天，培養(yǎng)終止前4 h加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，4 h后吸凈培養(yǎng)液，不吸掉孔板底部的甲瓚顆粒，加100 μl DMSO溶解甲瓚顆粒，振蕩5 min，酶標儀490 nm檢測光密度(OD)值。

1.2.5 流式細胞儀凋亡檢測 運用流式細胞儀Annexin-V PI復然法評估細胞凋亡情況。將轉染后的細胞懸液稀釋至細胞密度為106個/ml，取100 μl至FACS管中并分別加入5 μl Annexin V-PE和5 μl 7-AAD混勻，避光室溫孵育10 min，加入400 μl緩沖液，繼續(xù)孵育5 min，使用流式細胞儀分析檢測。

1.2.6 Western Blot分析 將轉染后的細胞使用胰酶消化，收集上清液，測定蛋白質濃度，并調節(jié)至相同濃度。然后，利用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞總蛋白，轉移至PVDF膜。使用5%脫脂奶粉封閉，加入相應一抗，孵育過夜后加入相應的二抗，再次孵育4 h。最后，加入ECL發(fā)光液，顯示與抗體相結合的蛋白條帶。使用Image Lab 3.0軟件測定每個條帶的相對強度。

2 結果

2.1 PSMB4基因的干擾效率 Western Blot檢測3個shRNA序列的干擾效率，如圖1所示，shCtrl組(對照組)、shRNA1組、shRNA2組及shRNA3組中PSMB4的相對表達量分別為0.911 3±0.007 7，0.568 9±0.013 0，0.437 8±0.013 2，0.220 2±0.006 7。與空載對照組相比，3個干擾序列展現(xiàn)的干擾效果差異均有統(tǒng)計學意義(shRNA1：t=22.67，P<0.000 1；shRNA2：t=30.88，P<0.000 1；shRNA3：t=67.82，P<0.000 1)。其中shRNA3序列對PSMB4的干擾效率最高，干擾效率約為80%，因此選擇shRNA3序列作為實驗組，用于后續(xù)細胞功能實驗。

圖1 SMMC7721細胞系中干擾PSMB4效率驗證

2.2 干擾PSMB4表達對SMMC7721細胞增殖及克隆形成的影響 干擾PSMB4表達后，MTT檢測結果顯示，實驗組第4、5天細胞OD490值低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)?？寺⌒纬蓪嶒烇@示實驗組中SMMC7721細胞集落數(shù)目明顯少于對照組(圖2)。

表1 MTT檢測兩組細胞的OD490值

圖2PSMB4干擾后對SMMC7721細胞克隆形成能力的影響

2.3 干擾PSMB4表達對SMMC7721細胞凋亡率的影響 干擾PSMB4表達后，流式細胞凋亡檢測結果顯示，實驗組細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率均明顯高于對照組(P值均<0.05)(圖3，表2)。

圖3 PSMB4干擾后對SMMC7721細胞凋亡的影響

表2 流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡率(%)

2.4 干擾PSMB4表達對核因子-κB(NF-κB)信號通路的影響 干擾PSMB4表達后，Western Blot檢測NF-κB信號通路中相關蛋白的表達。結果如圖4所示，對照組和實驗組中NF-κB亞基p65蛋白(pNF-κB)的相對表達量分別為0.801 5±0.012 0、0.284 1±0.011 0，而NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的相對表達量分別為0.481 6±0.011 2、0.658 3±0.014 2。與空載對照組相比，實驗組肝癌SMMC7721細胞中pNF-κB蛋白表達顯著降低(t=31.830，P<0.0001)，IκBα蛋白表達顯著增加(t=9.774，P=0.000 6)。

3 討論

近年來，研究[6-7]表明蛋白質穩(wěn)態(tài)失衡會導致神經(jīng)退行性疾病、心功能不全和癌癥等多種疾病的發(fā)生。蛋白酶體是維持蛋白質穩(wěn)態(tài)的一種重要的多亞基復合物，最近有多項研究[8]表明，其在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵的調節(jié)作用。例如，在乳腺癌細胞中，干擾蛋白酶體亞基PSMB5的表達可以抑制細胞的生長并能激活防御性M1巨噬細胞[9]；而在肝癌細胞中，干擾蛋白酶體亞基PSMB2表達可以抑制細胞的增殖和侵襲[10]。目前已有多種蛋白酶體抑制劑，如硼替佐米等作為化療藥物被用于臨床惡性腫瘤的治療。因此，抑制蛋白酶體活性在治療癌癥中具有可觀的應用前景[11-12]。

圖4干擾PSMB4表達對NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

PSMB4即26S蛋白酶體β亞基4型，此基因位于1q21，mRNA為925 bp，含有7個外顯子, 編碼29 kD大小的蛋白，主要分布于細胞核和細胞漿中[13]。最近的研究[5,14]表明，PSMB4可以促進包括神經(jīng)膠質瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤細胞的異常增殖。在本研究中，筆者通過shRNA干擾技術成功構建了PSMB4表達降低的SMMC7721細胞，并通過MTT、克隆形成實驗和流式細胞儀凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組細胞相比，干擾PSMB4表達可以抑制肝癌SMMC7721細胞的增殖存活。此外，據(jù)報道[15]蛋白酶體可以降解IκBα，從而激活NF-κB通路介導腫瘤細胞的生長與存活。在之前的研究中，有學者[16]發(fā)現(xiàn)PSMB4可以通過NF-κB-miR-21通路調控多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展。而在卵巢癌細胞中，抑制PSMB4表達可以下調NF-κB通路的活性，并增加NF-κB介導的蛋白質表達，如cyclin D1和cyclin E[17]。本實驗結果顯示，干擾PSMB4在肝癌細胞中同樣可以影響NF-κB通路相關蛋白的表達變化。這些結果表明，PSMB4可能通過激活NF-κB通路導致腫瘤細胞的生長增殖，促進惡性腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了干擾PSMB4可以抑制肝癌SMMC7721細胞的增殖與存活，其機制可能是抑制了NF-κB通路活性。然而，具體的作用機制尚未完全闡明，有待于進一步的深入研究。