邱文彬，于 江，張玉玉，沈文慧，楊 杰，陳 智，孫文博，陳 蕾，張 凡，張麗麗，楊桂文*，吳家強*

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟南250100；3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南250100；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 泰安 271000；5.煙臺市牟平區(qū)動物疫病預(yù)防與控制中心，山東 煙臺 264100)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是一種革蘭氏陰性細小桿菌，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴性，常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎等癥狀[1]。該病的發(fā)病率通常為10%～15%，嚴重時高達40%，死亡率可高達50%[2-4]。另外，由于病毒性疾病的入侵和流行造成豬群免疫力下降，免疫抑制性的疾病(如豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等)經(jīng)常與HPS發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，使疾病的預(yù)防與治療變得更為復(fù)雜，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失[5-6]。

按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)血清分型法, 目前可將HPS分為15個血清型,另有約15.2%～41%的菌株不能分型。HPS在世界各國流行的血清型不盡相同，不同血清型的HPS毒力也有很大差異，引起豬的臨床癥狀亦有差別[7-11]。

目前已有對HPS敏感性藥物的篩選及耐藥性的相關(guān)研究，不同菌株的藥物敏感性各有差異[12-16]。劉德成進行的特定菌株牛津杯藥敏試驗結(jié)果表明HPS分離株對乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考敏感性高，對頭孢噻呋鈉、氨芐西林、阿莫西林產(chǎn)生了耐藥性[12]。魏海林等研究發(fā)現(xiàn)HPS分離株對阿莫西林(56.7%)、氨芐西林(63.9%)、青霉素(74.2%)產(chǎn)生了較高的耐藥性[13]。由此可見該菌極易產(chǎn)生耐藥性，而且不同分離株之間也有差異，抗生素治療方案面臨諸多問題。

本研究采用細菌分離培養(yǎng)結(jié)合PCR鑒定的方法對2016-2018年山東省12個地區(qū)送檢的103個發(fā)病豬的病料進行HPS的分離鑒定，并進一步確定其血清型，同時分析該病的發(fā)生與季節(jié)和豬日齡的關(guān)系，以了解副豬嗜血桿菌病的流行情況。通過對HPS分離株LZ株和LC株的培養(yǎng)特性觀察、生化鑒定、藥敏試驗以及動物攻毒試驗，確定其最小發(fā)病劑量，為該病疫苗研制和防治提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 2016年-2018年山東省12個地區(qū)(包括聊城、淄博、濰坊、臨沂、萊蕪等)送檢發(fā)病豬的病料(包括肺臟、血液、心包液、關(guān)節(jié)液等)，共103份。來自山東省臨淄、聊城兩個大型養(yǎng)豬場的HPS分離株分別被命名為LZ株和LC株。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)為美國BD公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為Sigma公司產(chǎn)品；新生牛血清購自濟南勁牛公司；微量生化鑒定試劑和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；HPS標準菌株及陽性血清、金黃色葡萄球菌由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司。

1.1.3 試驗動物 3～4周齡健康易感仔豬購自山東省濱州市某豬場。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 無菌采集疑似副豬嗜血桿菌病的發(fā)病豬病料(肺臟、血液、心包液、關(guān)節(jié)液等)，接種于TSA培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察細菌菌落特征，挑取圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠樣菌落進行革蘭氏染色鏡檢，將鏡檢為可疑的菌落進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)特性試驗 將分離菌分別水平劃線接種于鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線接種，37 ℃培養(yǎng)后觀察細菌生長狀況。將分離菌分別接種于含0.001% NAD的鮮血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)后觀察有無溶血現(xiàn)象。

1.2.3 生化鑒定試驗 挑取具有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且不溶血的單菌落純化培養(yǎng)后，接種于含NAD的硝酸鹽還原、氧化酶、接觸酶、吲哚、蔗糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖、甘露醇等微量生化反應(yīng)管中，37℃培養(yǎng)，觀察其生化特性。

1.2.4 PCR鑒定 采用直接煮沸法從HPS分離株培養(yǎng)物中提取DNA[17]，根據(jù)Oliveira等[18]報道合成1對特異引物，上游引物為5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，下游引物為5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′,該引物擴增編碼16SrRNA長度約為822 bp，由上海生物工程有限公司合成。PCR擴增方法按文獻[19]進行。

1.2.5 血清學(xué)鑒定 根據(jù)蔡旭旺[17]方法制備各分離菌株的血清學(xué)分型抗原，以各血清型標準血清對各分離株進行瓊脂擴散試驗，以確定各分離株的血清型。

1.2.6 藥敏試驗 將HPS LZ株和LC株的純培養(yǎng)物制成菌懸液，用滅菌棉簽均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，選取多種抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～48 h，測量抑菌環(huán)直徑。

1.2.7 動物攻毒試驗 將HPS LZ株和LC株密集劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，將菌液涂布于TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)20～24 h后，收集細菌并將菌液的活菌數(shù)調(diào)整為約3.0×109CFU/mL。參照蔡旭旺的研究結(jié)果[20]，采用腹腔注射攻毒，應(yīng)用4個攻毒劑量進行動物攻毒試驗。選取3～4周齡健康易感仔豬90頭，隨機分成9組，每組10頭，4個組別分別以1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL 4個不同劑量腹腔注射LZ株菌液(約3.0×109CFU/mL)和LC株菌液(約3.0×109CFU/mL)，另外1組腹腔注射PBS 2.5 mL作為對照。連續(xù)觀察2周，記錄各組動物體溫變化和臨床表現(xiàn)，剖檢后觀察病理變化。同時取病變組織接種培養(yǎng)基進行細菌分離及PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 山東地區(qū)副豬嗜血桿菌病流行病學(xué)調(diào)查和血清型鑒定結(jié)果

共分離獲得29株HPS分離株。采用瓊脂擴散試驗對29株HPS分離株進行血清學(xué)分型，結(jié)果如表1所示，28株分離菌株可以確定血清型，1株不與15種血清型當(dāng)中任何血清型發(fā)生反應(yīng)。血清學(xué)分型結(jié)果顯示，在山東省以血清4型(27.6%)和5型(20.7%)最為流行，其次是血清1型(13.8%)、12型(13.8%)、13型(10.3%)，而血清2、10、14型各分離到1株，血清3、6、7、8、9、11、15型目前尚未分離到菌株。來自山東臨淄、聊城兩個大型養(yǎng)豬場的LZ株和LC株的血清型分別為血清型5型和1型。

統(tǒng)計顯示發(fā)病時間主要集中于每年的3、4、10、11月份(表2)，發(fā)病豬中有8例日齡為0～30 d，18例日齡為31～50 d，3例日齡為51～80 d。

表1 HPS分離菌株血清型鑒定結(jié)果Table 1 Results of serotype of HPS strains identified

注：陽性率=(陽性數(shù)/分離株數(shù))×100%。下同。

Note：Positive rate = (number of positive isolates / total number of isolates) × 100%.The same below.

表2 不同月份HPS分離菌株的檢出情況Table 2 The detection of HPS strains identified

2.2 分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

用HPS特異性引物進行PCR擴增，從菌液和病豬組織中均獲得了長度為822 bp的DNA片段，與試驗預(yù)期吻合(圖1)。PCR產(chǎn)物由上海生工進行測序，所得序列在GenBank中進行BLAST比對，同源性達到98%以上?？纱_定29株分離株均為HPS。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

分離株在TSA固體培養(yǎng)基上，可長出較多的圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠狀小菌落(圖2)。取上述菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢觀察，細菌為革蘭氏陰性的細小桿菌，呈球桿狀、短桿狀、長桿狀、間或絲狀等多種形態(tài)(圖2)。

2.4 培養(yǎng)特性試驗結(jié)果

LZ株和LC株在鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板上均不生長，但在鮮血瓊脂平板上與金黃色葡萄球菌同時培養(yǎng)時，均在金黃色葡萄球菌線兩側(cè)長出針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落，呈現(xiàn)出“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”。在含NAD的鮮血瓊脂平板上也可形成灰白色透明、針尖大小且不溶血的微小菌落。

2.5 生化鑒定試驗結(jié)果

結(jié)果表明LZ株和LC株對硝酸鹽還原、接觸酶、葡萄糖、果糖的發(fā)酵結(jié)果均為陽性；對吲哚、氧化酶、甘露醇的發(fā)酵結(jié)果均為陰性。其余發(fā)酵結(jié)果均為部分陽性。該試驗結(jié)果表明LZ株和LC株均符合HPS的生化特性。

2.6 藥敏試驗結(jié)果

結(jié)果顯示多種抗生素可使LZ株和LC株產(chǎn)生抑菌環(huán)(圖3)，其中LZ株對青霉素類、頭孢類等藥物高度敏感，對慶大霉素、卡那霉素等中度敏感，對林可霉素、鏈霉素低度敏感；LC株對青霉素類、頭孢類等藥物高度敏感，對慶大霉素、林可霉素等中度敏感，對卡那霉素、鏈霉素低度敏感(表3)。

2.7 動物攻毒試驗結(jié)果

2.7.1 攻毒仔豬的臨床癥狀 用不同劑量的LZ株和LC株對仔豬分別攻毒后，大部分仔豬體溫在攻毒第2日或第3日開始升高，持續(xù)2～5 d后，體溫逐漸恢復(fù)正常(圖4)。HPS的攻毒劑量越大，試驗豬的最高體溫越高，死亡越快。對照組仔豬體溫均正常。攻毒后的大部分仔豬不同程度地出現(xiàn)被毛粗亂、精神不振、食欲減退等癥狀，部分攻毒仔豬還伴有咳嗽、嘔吐，以及后肢膝關(guān)節(jié)腫脹、右后肢跛行、臥地不起、臨死前側(cè)臥轉(zhuǎn)圈或前肢呈劃水樣等臨床癥狀(表4)。向仔豬注射相同攻毒劑量的LZ株和LC株菌液后，注射LZ株菌液的仔豬發(fā)病更早，并且死亡率更高。

表3 常見抗生素對HPS LZ株和LC株的抑菌圈大小Table 3 Inhibition circle size of common antibiotics against HPS LZ strain and LC strain mm

2.7.2 攻毒仔豬體內(nèi)HPS的分離鑒定 取發(fā)病死亡仔豬的心包積液、胸腔積液、腹腔積液和心血分別接種于TSA培養(yǎng)基上，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，長出菌落后經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陰性短桿菌。經(jīng)PCR鑒定，從攻毒后發(fā)病豬分離出的細菌分別與LZ株和LC株一致，PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖5。

2.7.3 攻毒仔豬的病理特征及不同濃度菌液的致病率比較 LZ株和LC株均能引起嚴重的纖維素性滲出，解剖發(fā)病豬可見經(jīng)典的“絨毛心”和腹膜炎癥狀(圖6)，除此之外部分發(fā)病豬還出現(xiàn)心臟和肺臟粘連、淋巴結(jié)腫大、腹腔粘連、關(guān)節(jié)液增多、肺臟出血、腦膜出血、腦膜炎、漿膜炎、胸腔和心包內(nèi)積液且渾濁、肺臟肉變、肺臟表面有出血點、心臟表面或胸腹腔內(nèi)有纖維素性滲出物、關(guān)節(jié)液增多等病理特征。不同劑量LZ株和LC株對仔豬進行攻毒，其發(fā)病率和死亡率見表5。試驗仔豬的發(fā)病率和死亡率隨著HPS攻毒劑量的加大而增高。試驗結(jié)果顯示，LZ株選用1.5 mL菌液(約3.0×109CFU/mL)進行攻毒可使100%仔豬發(fā)病，LC株選用2.0 mL菌液(約3.0×109CFU/mL)進行攻毒可使100%仔豬發(fā)病。

表4 LZ株、LC株不同攻毒劑量仔豬的臨床癥狀Table 4 Clinical symptom of piglets injected with different doses of LZ and LC strains

圖5攻毒發(fā)病豬分離的細菌PCR鑒定結(jié)果
M.DL2000 DNA Marker；1～5.LZ株攻毒；
8～12.LC株攻毒；6.陰性對照；7.陽性對照
Fig. 5 PCR identification of bacteria isolated from infected pigs
M.DL2000 DNA Marker; 1～5.Infected with LZ strains;
8～12.Infected with LC strains; 6.Negative control;
7.Positive control

圖6LZ株和LC株引起的剖檢變化
A，C.胸膜炎和絨毛心；B,D.腹膜炎
Fig. 6 Changes in necropsy caused by LZ and LC strains
A，C. Pleurisy and villus heart; B, D. Peritonitis

因此，本次動物攻毒試驗中，LZ株菌液的最小發(fā)病量為4.5×109CFU，LC株菌液的最小發(fā)病量為6.0×109CFU。

3 討 論

副豬嗜血桿菌病為危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，在世界范圍內(nèi)引起了廣泛重視。本研究對103份疑似病料進行檢測，結(jié)果顯示HPS的分離率約為28.16%。不同地域和養(yǎng)殖環(huán)境中，HPS的各種血清型的流行情況也不盡相同，雖然流行情況各有差異，但統(tǒng)計結(jié)果表明4型和5型HPS最為流行[6,17]。本研究確定了當(dāng)前山東地區(qū)流行的HPS主要是血清4型和5型，其次是1、12型，說明目前該病的血清型流行情況相對穩(wěn)定。

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在菌，正常條件下不致病，但在斷奶、通風(fēng)不良、氣溫劇變、混群、長途運輸?shù)雀鞣N應(yīng)激因素的作用下，破壞其上呼吸道的防御機制，引起上呼吸道粘膜的損傷，從而導(dǎo)致敏感豬發(fā)生全身感染。該病一年四季均可發(fā)生，但在早春(3、4月份)和深秋(10、11月份)由于晝夜溫差大及通風(fēng)不良等原因，更易暴發(fā)流行。副豬嗜血桿菌易感2周齡到4月齡的豬，但以5～8周齡的斷奶保育仔豬最為多見。本研究也發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬多集中于31～50日齡，這與仔豬的早期斷奶養(yǎng)殖模式及其母源抗體的消長規(guī)律有關(guān)。

抗生素的不合理使用以及抗菌藥物的選擇壓力等因素加重了細菌的耐藥性[21]，據(jù)國內(nèi)外研究表明，HPS耐藥性廣泛，對不同藥物的敏感性亦有地域性差異。大多數(shù)HPS已經(jīng)對林可霉素、四環(huán)素和紅霉素產(chǎn)生抗性[22]。劉玉英[14]的研究結(jié)果表明HPS對氯霉素和頭孢噻柄敏感,對阿莫西林和氨芐青霉素等產(chǎn)生了耐藥性。Martín de la Fuente等[15]的研究結(jié)果表明所有英國HPS分離株均對青霉素、頭孢噻呋、紅霉素、替米考星、恩諾沙星和氟苯尼考敏感，所有西班牙分離株僅對氟苯尼考敏感，對青霉素等耐藥率較高。Zhou等[23]對此也進行過研究報道，HPS對恩諾沙星產(chǎn)生抗性，對頭孢噻肟、頭孢噻呋、阿奇霉素、氯霉素、氟苯尼考和替米考星等敏感，可用于副豬嗜血桿菌病的治療。Aarestrup等[16]進行耐藥性研究試驗中的所有HPS分離株均對氨芐西林、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、紅霉素等沒有抗性，其中兩種分離株對甲氧芐氨嘧啶+磺胺甲惡唑有耐藥性，部分分離株對環(huán)丙沙星和TMP+磺胺甲惡唑的敏感性降低。另外，Sun等[24]發(fā)現(xiàn)馬波沙星對HPS具有抗菌活性，并測定了198株HPS分離株的最小抑菌濃度(MIC50為2 mg/L，MIC90為8 mg/L)。本研究中，LZ株和LC株均對青霉素類、頭孢類等藥物敏感性高，LZ株對林可霉素、鏈霉素敏感性低，LC株對卡那霉素、鏈霉素低敏，菌株耐藥性與上述研究結(jié)果部分吻合，但亦有差異，為HPS不同菌株的防治提供了依據(jù)?？股胤N類繁多，HPS各菌株對不同種類抗生素的耐藥性差異較大，而且同一種菌株的耐藥性也會發(fā)生變化，因此對HPS菌株的耐藥性進行及時、廣泛和精準的檢測對副豬嗜血桿菌病的治療尤為重要。

表5 LZ株、LC株不同攻毒劑量仔豬的發(fā)病和死亡情況Table 5 Incidence and mortality of piglets injected with different doses of LZ and LC strains

注：a.出現(xiàn)食欲減退、精神沉郁、咳嗽、呼吸困難和被毛粗亂等臨床癥狀；b.體溫升高0.5 ℃以上，并持續(xù)2～5 d；c.剖檢出現(xiàn)心包積液、腹水增多、胸腔或腹腔內(nèi)有纖維素性滲出物，肺臟出血或肉變、淋巴結(jié)腫大、后肢關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液增多等病理變化。

Note：a. indicates that the attacked pig has clinical symptoms such as anorexia，mental depression，cough，dyspnea and the coat is rough and disorder；b. indicates that the body temperature rises above 0.5 ℃ and lasts for 2 to 5 days；c. indicates the results of the necropsy，including the pericardial effusion，ascites increased，fibrinous exudate in the thoracic or cavum abdominis，pulmonary hemorrhage or sarcoidosis，lymphadenectasis，increased synovial fluid in the Hindlimb articular cavity，and so on.

王樂等[11]進行的豚鼠和仔豬HPS毒性試驗結(jié)果表明，12和14型毒力最強(LD50低于3.5×108CFU)，其次是血清型5型，13型毒力最弱，4型菌株間有差異，研究結(jié)果與國外研究報道部分相一致[25]，說明部分血清型與毒力之間可能存在一定的聯(lián)系，也有研究表明HPS的血清型和致病型與基因組水平的差異有關(guān)[26]，基因組水平的差異對毒力起決定性影響。本試驗用不同劑量的LZ株和LC株對仔豬分別攻毒，解剖病理特征與尹秀鳳[8]、Zhang等[27]的研究發(fā)現(xiàn)部分相吻合，攻毒后仔豬的臨床癥狀包括體溫明顯升高、被毛粗亂、精神不振、呼吸困難、咳嗽、臥地不起等，解剖發(fā)病豬的病理特征包括“絨毛心”和腹膜炎等。本研究還確定了LZ株和LC株的動物攻毒試驗的最小發(fā)病量，證明兩者都具有較強的毒性，對分離株的致病性進行研究有著重要意義，可為該病的疫苗研制和綜合防治提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究對山東省12個地區(qū)的發(fā)病豬場的副豬嗜血桿菌病進行了流行病學(xué)和血清學(xué)調(diào)查，并用其分離株LZ株和LC株進行了生物特性和動物致病性試驗。結(jié)果顯示山東地區(qū)確有副豬嗜血桿菌病的流行(分離率為28.16%)，其中4型和5型血清型最為流行。研究發(fā)現(xiàn)LZ株和LC株毒力較強，且均對青霉素類、頭孢類等藥物有較高的敏感性。本研究為副豬嗜血桿菌病菌病的診斷與防治提供了重要依據(jù)，具有一定的臨床應(yīng)用和理論價值。