鄭金娟 陳一方 曲超 肖瑤 金丹

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，吉林 延吉 133000)

哮喘主要特征是可逆性氣流受限，此外，與氣道重塑和氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)〔1〕。哮喘的發(fā)病機制非常復(fù)雜，目前的研究普遍認為哮喘是由多種炎癥細胞(嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等)及炎癥細胞組分參與的氣道炎癥疾病〔2〕。干鱈魚皮膠原低聚肽粉(CP)主要成分是天冬氨酸、甘氨酸和蘇氨酸，具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏、提高免疫力等功能〔3〕，提示 CP 可能在哮喘中起作用。NDD樣受體蛋白(NLRP)3炎癥小體是目前研究的熱點，通常是由NLRP3蛋白、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1和含Caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(ASC)組成〔4〕。NLRP3炎癥小體是Caspase-1活化所必需的平臺，而活化的Caspase-1能夠調(diào)控白細胞介素(IL)-1β和IL-18等炎癥細胞因子的表達與活化〔5〕。NLRP3炎癥小體與各種炎性疾病有著密切的關(guān)聯(lián)。本文擬探索CP是否可以通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的表達來預(yù)防哮喘的發(fā)生與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 CP由中國吉林省延邊朝鮮族自治州延吉市海嬌生物科技有限公司提供；卵清蛋白(OVA)和氫氧化鋁佐劑(Alum)均購自美國Sigma公司；NLRP3及Caspase-1均購自英國Abcam公司；ASC抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；IL-4購自美國R&D Systems公司；IL-5購自美國Novus Biologicals公司。

1.2儀器與設(shè)備 TC-512聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)梯度擴增儀(TECHNE，英國)；水平瓊脂糖凝膠電泳儀(HOEFER，美國)；電泳儀、垂直凝膠電泳槽、垂直轉(zhuǎn)印槽(Bio-rad，美國)；低溫高速離心機(Eppendorf，德國)；凝膠成像儀(UVP，美國)；Nano drop 2000-紫外可見分光光度計(Thermo，美國)；NE-U12 霧化器(Omron，日本)。

1.3動物模型的建立 健康的清潔級雄性Balb/C小鼠50只，6～8周齡，18～22 g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。小鼠在標準實驗室條件(20～24℃，12/12 h光-暗循環(huán))下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，提供水和自由飲食。小鼠隨機分為正常組、模型組及CP組，CP低、中、高劑量組通過灌胃法連續(xù)20 d給予300、600和900 mg/kg CP預(yù)處理。同時，正常組和模型組給予等量生理鹽水20 d。除正常組外，模型組及CP預(yù)防組在第1、7、14天給予腹腔注射2.5 mg/ml OVA溶液(25 mg OVA加4 ml Alum和6 ml生理鹽水)0.2 ml。從第17～19天，通過霧化器霧化吸入1%OVA生理鹽水溶液(100 mg OVA加10 ml生理鹽水)30 min來激發(fā)致敏小鼠。第21天處死小鼠。取肺組織，右肺分為兩部分，放入液氮中速凍，-80℃保存，左肺至于 4% 甲醛溶液中固定。

1.4組織學(xué)檢查 甲醛固定后的肺組織經(jīng)常規(guī)脫水包埋，切成4 μm厚度切片，置于防脫落載玻片上，脫蠟透明等過程后進行蘇木精-伊紅(HE)染色、Masson染色。每只小鼠隨機選3張肺組織切片，每張切片隨機選取橫斷面較圓的細支氣管用光學(xué)顯微鏡放大200倍觀察。

1.5逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測IL-4、IL-5、NLRP3、ASC和Caspase-1在肺組織中mRNA的表達情況 以β-actin為內(nèi)參照。相關(guān)引物序列如下：β-actin:上游5′-TCTGGTCGTACCACAGGCAT-3′，下游5′-CGCTCGTTGCCAATAGTGAT-3′，產(chǎn)物長度為329 bp；IL-4：上游5′-TCATCGGCATTTTGAACGAGGT-3′，下游5′-GCATCGAAAAGCCCGAAAGAG-3′，產(chǎn)物長度為224 bp；IL-5：上游5′-AGCACAGTGGTGAAAGAGACCTT-3′，下游5′-TCCAATGCATAGCTGGTGATTT-3′，產(chǎn)物長度為117 bp；NLRP3：上游5′-GAGTTCTTCGCTGCTATGT-3′，下游5′-ACCTTCACGTCTCGGTTC-3′，產(chǎn)物長度為107 bp；ASC：上游5′-ACACTTTGTGGACCAGCACA-3′，下游5′-CACGAACTGCCTGGTACTGT-3′，產(chǎn)物長度為116 bp；Caspase-1：上游5′-TATCCAGGAGGGAATATGTG-3′，下游5′-ACAACACCACTCCTTGTTTC-3′，產(chǎn)物長度為170 bp。使用Trizol試劑提取右肺總RNA，然后使用mRNA作為模板，使用Oligo(dT)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；然后將第一條cDNA用作模板，使用基因特異性引物和DNA聚合酶進行PCR擴增，得到所需的目的基因。β-actin擴增程序為95℃ 5 min，1個循環(huán)，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，1 個循環(huán)72℃ 5 min，4℃保持30 min。IL-4與IL-5擴增程序與β-actin相同，NLRP3、ASC和Caspase-1退火溫度為58℃，其余與β-actin相同。將產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，15 min)，在凝膠成像儀中檢測并照相。應(yīng)用Image J軟件檢測電泳條帶的光密度，分析mRNA表達的強度。

1.6Western印跡法檢測肺組織中IL-4、 IL-5、 NLRP 3、ASC和Caspase-1的蛋白質(zhì)水平的表達量 以β-actin為內(nèi)參照。使用蛋白提取試劑盒提取肺組織中總蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。取60 μg蛋白煮沸4 min后，經(jīng)8%～15%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉-TBST溶液室溫封閉1 h，加入抗NLRP3、Caspase-1兔多克隆抗體，抗IL-4、IL-5大鼠多克隆抗體和抗ASC、β-actin兔單克隆抗體，4℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、羊抗大鼠IgG稀釋度為1∶4 000，37℃，90 min。洗膜后在暗室中加電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑，X光膠片曝光1～2 min后顯影、定影。對圖像進行掃描，應(yīng)用Image J軟件對條帶進行檢測，分析蛋白質(zhì)表達的強度。

1.7免疫組織化學(xué)染色 將肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，使用檸檬酸鹽加熱至 80～90℃，待降溫至30℃，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次2 min。3%H2O2去離子水孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。 PBS 清洗3次，每次3 min。滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min，傾去，勿洗。滴加1∶300抗 NLRP3和1∶50抗Caspase-1兔多克隆抗體，4℃冰箱過夜。次日PBS清洗3次，每次3 min，并加入生物素化二抗工作液(抗兔IgG)。PBS清洗3次，每次3 min。滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min。PBS清洗3次，每次3 min。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液避光條件下染色4 min，自來水沖洗10 min，蘇木素染色30 s，自來水沖洗30 min。進行切片常規(guī)脫水，透明并使用中性樹膠密封。光學(xué)顯微鏡下放大200倍觀察。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism7軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1CP改善哮喘模型小鼠的肺損傷 HE 染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組發(fā)生了顯著的病理改變，如炎性細胞浸潤、管腔狹窄、間質(zhì)水腫等。 CP低、中、高劑量組上述改變較模型組明顯減輕。Masson 染色結(jié)果顯示，模型組與模型組相比，上皮膠原纖維沉積，氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，但CP各預(yù)防組中膠原纖維沉積與正常組基本相同，明顯少于模型組，見圖1。

圖1 CP對哮喘小鼠肺組織損傷的影響(×200)

2.2CP減少哮喘模型小鼠肺組織中 IL-4、 IL-5、 NLRP3、 ASC、 Caspase-1 mRNA 的表達 與正常組相比，模型組肺組織中IL-4、IL-5、NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA 表達明顯升高(P<0.01)，然而，CP 處理顯著抑制了增加的趨勢，CP高劑量組各指標差異顯著(P<0.05,P<0.01)，CP中劑量組IL-5和CP低劑量組NLRP3差異顯著(P<0.01、P<0.05)，見表1、圖2。

表1 各組肺組織IL-4、IL-5、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA的表達

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.3各組肺組織IL-4、 IL-5、 NLRP3、 ASC、 Caspase-1 蛋白表達 經(jīng)圖像分析顯示，與正常組相比，模型組肺組織IL-4、 IL-5、 NLRP3、 ASC 和Caspase-1 蛋白表達明顯升高，CP處理顯著抑制了增加的趨勢，見圖3。

2.4CP對哮喘模型小鼠肺組織中 NLRP3炎癥小體的抑制作用 模型組 NLRP3和Caspase-1的表達與正常組相比明顯升高，而 CP 低、中、高劑量組不同程度降低了 NLRP3和Caspase-1的表達，趨近于對照組。見圖4。

圖2 各組肺組織IL-4、IL-5、ASC、Caspase-1、NLRP3 mRNA的表達

1～5：正常組、模型組、CP低劑量組、CP中劑量組、CP高劑量組圖3 各組肺組織IL-4、IL-5、ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白的表達

圖4 各組肺組織Caspase-1和NLRP3蛋白的表達(DAB，×200)

3 討 論

CP是通過對新鮮或冰凍鱈魚皮浸泡后組織分解成流體，在經(jīng)過生物酶解及分離純化等過程，最終以冷凍干燥獲得深海鱈魚皮萃取的膠原低聚肽粉〔6〕。其平均分子量小于1 kD，易被人體吸收，可以補充人體組織所需的氨基酸，使人體細胞能夠充分補充能量、核苷酸、電解質(zhì)和細胞信號調(diào)節(jié)因子，巨噬細胞和淋巴細胞的免疫功能也增加〔7〕。有研究指出海洋魚皮膠原低聚肽粉被人體吸收后水解成膠原多肽，對過敏有抑制作用〔8〕，哮喘是過敏性疾病的一種，所以猜測 CP 可能預(yù)防哮喘的發(fā)生。

以嗜酸性粒細胞和 T 淋巴細胞為主的炎癥細胞及其產(chǎn)生的炎癥細胞因子等參與了哮喘的發(fā)病機制，其中由 Ⅱ 型輔助性 T 淋巴細胞(Th2)產(chǎn)生的 IL-4 和 IL-5 被認為是關(guān)鍵的促炎性細胞因子〔9〕，在哮喘發(fā)病過程中其表達是上調(diào)的〔9，10〕，而且 Th2 細胞可以誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生和聚集，輔助 B 細胞產(chǎn)生 IgE 等，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)〔11，12〕。本研究說明CP能夠預(yù)防哮喘炎癥過程的發(fā)展。

隨著對 NLRP3炎癥小體研究的深入，越來越多的炎性疾病被證明與炎癥小體密切相關(guān)〔13〕。 在各種炎癥中NLRP3炎癥小體主要通過ASC招募Caspase-1前體，使其發(fā)生水解，水解后產(chǎn)生的Caspase-1是具有酶活性的，可以促進炎癥因子IL-1β和IL-18切割和成熟，從而促進細胞凋亡，調(diào)節(jié)固有免疫并發(fā)揮生物學(xué)功能〔14〕。而IL-1β和IL-18炎癥因子產(chǎn)生可引起免疫細胞激活，增加其他炎癥相關(guān)細胞因子產(chǎn)生，促進炎癥發(fā)展。IL-1β可以促進嗜酸性粒細胞募集〔15〕，而IL-18可以增強Th2細胞應(yīng)答，促進T細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌IL-4、IL-13〔16〕。這些研究都表示哮喘與NLRP3炎癥小體之間可能存在關(guān)聯(lián)。但其在哮喘中的作用研究較少，目前還沒有定論。本研究提示NLRP3炎癥小體在哮喘中發(fā)揮著重要作用，CP可以通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活化對小鼠實驗性哮喘發(fā)揮防治作用。