黎飚 李海 黃凌凌 顧建忠 楊潔 方曉燕

(右江民族醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,廣西 百色 533000)

摘除卵巢(OVX)是老年女性骨質(zhì)疏松最為經(jīng)典動物造模。OVX影響骨組織，引起骨質(zhì)疏松，對其相關(guān)模型動物治療研究較多，但OVX對骨組織影響同時，是否影響到骨中造血組織，從而影響到紅細胞和血紅蛋白水平，這方面研究還未見報道。研究觀察烏圓口服液及山茶籽聯(lián)合烏圓口服液對OVX大鼠骨組織及血液影響。

1 材料和方法

1.1材料和設(shè)備 選用80只5月齡雌性SPF級大鼠，用上海那艾精密NAI3537型血細胞分類計數(shù)器,對紅細胞進行計數(shù)。使用美國DS-5糖化血紅蛋白分析儀對大鼠血液血紅蛋白測定，用南京建成生物科技有限公司生成的血磷、鈣和堿性磷酸酶試劑盒測定血清磷、鈣和堿性磷酸酶。

1.2動物分組 按體重給大鼠進行編號標注，隨機取出大鼠裝入分4組飼養(yǎng)籠，同條件常規(guī)飼養(yǎng)，用不含豆粉飼料進行喂養(yǎng)。

1.3對照組 隨機取出其中一組20只大鼠，常規(guī)消毒后，用戊巴比妥鈉晶體配制成濃度為10 g/L注射液，按3.0 mg/kg吸取注射液注入腹腔，在大鼠進入麻醉后，從脊椎骨兩側(cè)的背部卵巢對應(yīng)部位切開進入腹腔，勾出卵巢和其周圍脂肪墊，深顏色是卵巢，淺顏色是脂肪墊，切除一塊相當于卵巢大小脂肪墊，注意不傷及卵巢。

1.4OVX和鉛中毒動物模型的建立 隨機取出其中一組20只大鼠，常規(guī)消毒后，用戊巴比妥鈉晶體配制成濃度為10 g/L注射液，按3.0 mg/kg吸取注射液注入腹腔，在大鼠進入麻醉后，從脊椎骨兩側(cè)的背部卵巢對應(yīng)部位切開進入腹腔，勾出卵巢和其周圍脂肪墊，深顏色是卵巢，淺顏色是脂肪墊，小心分離出雙側(cè)卵巢并進行切除，小心別劃破卵巢動脈，縫合切除傷口后酒精消毒再涂擦三慶大注射液，避免切口感染。切下組織塊要鑒定確為卵巢組織。同樣方法再對其他兩組大鼠OVX。

1.5用藥 烏圓口服液+OVX(W+OVX)組,在去卵巢1 w后，用按6 ml/kg劑量進行灌胃，每周用藥5 d，每天用藥1次，連續(xù)8 w。山茶籽+烏圓口服液+OVX(H+W+OVX)組,去卵巢1 w后用3 ml/kg烏圓口服液+3 ml/kg山茶籽醇提物溶液劑量的混合液進行灌胃，每周用藥5 d，每天用藥1次，連續(xù)8 w，山茶籽醇提物3 ml/kg，相當于5 g生藥/kg。對照組在切除脂肪墊1 w后，用按6 ml/kg劑量生理鹽水進行灌胃，每周用藥5 d，每天用藥1次，連續(xù)8 w。

1.6檢測指標 骨組織(鏡下骨組織結(jié)構(gòu))；血清磷、鈣和堿性磷酸酶、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白和雌二醇。

1.7實驗取材和測定 實驗第8 w后，各實驗組在麻醉大鼠后采其心血5 ml，失血致死取后雙右股骨。吸取20 μl血測定血紅蛋白，測定方法是美國DS-5糖化血紅蛋白分析儀。2 ml用于紅細胞計數(shù)，用血細胞分類計數(shù)器。其余血通過離心分離，取上層血清， -200℃條件下密封存放待測。血磷、鈣和血堿性磷酸酶用南京建成試劑盒進行測定，嚴格按試劑盒說明書進行操作，用放射免疫化學(xué)發(fā)光方法測定雌二醇濃度。各組股骨制成骨切片染色后放大100倍觀察其鏡下組織形態(tài)。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各實驗組光鏡下骨切片組織結(jié)構(gòu) 對照組骨皮質(zhì)厚，骨小梁稀疏均勻，骨細胞大小一致，整齊排列,鈣鹽豐富，均勻沉積。OVX組骨皮質(zhì)明顯薄，骨細胞大小不等，排列參差不齊紊亂。骨小梁疏密不均、斷裂不全，沉積鈣鹽減少，顏色變淺，髓腔擴大明顯，表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松鏡下改變。W+OVX組的光鏡下骨切片組織結(jié)構(gòu)還是有明顯骨質(zhì)疏松病理特征，與OVX組有相似病理改變，病理改善不明顯。H+W+OVX組光鏡下骨切片組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出疏松的病變明顯改善。骨皮質(zhì)厚，骨小梁稀疏均勻，骨細胞大小一致，整齊排列,鈣鹽豐富，均勻沉積。見圖1。

圖1 股骨骨組織光鏡結(jié)構(gòu)圖(HE染色，×100)

2.2各組血紅蛋白、紅細胞計數(shù)、血雌二醇測定比較 待結(jié)束實驗時候，進入實驗大鼠無一脫失，均取得相應(yīng)實驗結(jié)果。與對照組比較，OVX組的紅細胞計數(shù)、血紅蛋白和雌二醇明顯降低(P<0.05)；與OVX組比較，H+OVX組和H+W+OVX組紅細胞計數(shù)、血紅蛋白和雌二醇明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與W+OVX組比較，H+W+OVX組紅細胞計數(shù)、血紅蛋白雌二醇明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組血磷、鈣和堿性磷酸酶比較 與對照組比較，OVX組和W+OVX組血磷、鈣明顯降低(P<0.05)，血堿性磷酸酶明顯升高(P<0.05);與OVX組比較，H+W+OVX組血鈣、磷明顯升高(P<0.05)，血堿性磷酸酶明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組血紅蛋白、紅細胞計數(shù)和雌二醇測定結(jié)果

與對照組比較:1)P<0.05；與OVX組比較:2)P<0.05,3)P<0.01；與H+OVX組比較:4)P<0.05，下表同

表2 各實驗組血磷、鈣和堿性磷酸酶的測定結(jié)果

3 討 論

OVX使得機體主要雌激素來源去除，自然體內(nèi)(包括血液在內(nèi))雌激素急劇下降，引起一系列雌激素缺乏的病理生理的改變，比如更年期綜合征，記憶力減退，最為明顯的是老年女性骨質(zhì)疏松〔1，2〕。也有造血功能下降導(dǎo)致貧血，氣喘乏力臨床表現(xiàn)。

骨細胞在培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)雌激素提高成骨細胞生長分化能力，骨細胞周圍基質(zhì)增加明顯〔3,4〕。雌激素體內(nèi)水平下降引起骨質(zhì)流失和生成呈負平衡，磷、鈣降低。鈣鹽是骨的支架，也是骨堅硬所在。血鈣升高對甲狀旁腺分泌的激素，甲狀旁腺激素(也稱升鈣素)有抑制作用。長時間低鈣回引起甲狀旁腺主細胞分泌升鈣素，而升鈣素促進進骨質(zhì)中鈣鹽中的鈣溶解稀出，提高游離血鈣，骨磷伴隨流失。隨著低鈣的延長，低鈣所致骨質(zhì)疏松日益加重。骨質(zhì)疏松引起體內(nèi)促進骨質(zhì)合成激素增加，骨代謝顯得更加活躍，而骨代謝活躍觀察指標就是堿性磷酸酶，所以O(shè)VX組大鼠堿性磷酸酶升高〔5〕。臨床使用雌激素類制劑和降鈣素防治骨質(zhì)流失，就是基于上述機制〔6,7〕。

雌激素缺少引起骨質(zhì)流失同時，也會影響骨髓造血功能引起紅細胞計數(shù)、血紅蛋白下降。中成藥烏圓口服液具有補血功能，提高骨髓造血功能，從而提高模型組的紅細胞計數(shù)和血紅蛋白量，但改善貧血功能沒有H+W+OVX組明顯，說明對于老年雌激素缺乏貧血患者，在使用補血藥物同時，加用雌激素類藥物，治療貧血效果更好。烏圓口服液也不能改善骨質(zhì)疏松的病理改變，而補血藥加上雌激素類藥物，既可以治療老年雌激素缺乏伴有貧血〔8～10〕，又可治療老年女性雌激素缺乏骨質(zhì)疏松。因為雌激素通過提高護骨素，減少核因子-κB 受體活化因子配體(RANK)，活躍成骨細胞，壓抑破骨細胞，從而增加骨質(zhì)合成，抑制骨質(zhì)流失。所以山茶籽聯(lián)合烏圓口服液既護骨又補血雙重作用。