李麗莉，何艷軍，姚依秀，范敏*，高杰

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

西瓜(Citrulluslanatus)為葫蘆科西瓜屬一年生藤本植物，是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位[1]?？菸∈怯杉怄哏牭稐U菌(Fusariumoxyporumf.sp.niveum)引起的一種世界性土傳病害[2]，病原菌可在土壤中存活多年并逐漸積累，一般在連作地區(qū)發(fā)病較為嚴(yán)重。西瓜枯萎病發(fā)病率一般在20%～40%左右，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80%，甚至絕產(chǎn)[3-5]。西瓜枯萎病病原菌主要從根部侵入，通過阻塞維管束和導(dǎo)管來影響植物的水分運(yùn)輸，造成植株萎蔫；同時(shí)分泌毒素，干擾寄主代謝功能，并且積累大量的酮類化合物，使寄主導(dǎo)管處變?yōu)楹稚踔了劳鯷6]；植株在整個(gè)生育期都會(huì)發(fā)??；西瓜幼苗發(fā)病時(shí)頂端呈失水狀，子葉和葉片萎蔫下垂，莖蔓基部失水皺縮，嚴(yán)重時(shí)變?yōu)楹稚⑩У?。目前防治西瓜枯萎病的方法有嫁接[7]、化學(xué)防治[8-9]等措施，其中利用抗病品種防治西瓜枯萎病是最為經(jīng)濟(jì)有效的措施[10]。

西瓜抗病性鑒定、篩選、評(píng)價(jià)工作是抗病育種的重要環(huán)節(jié)。建立客觀的接種鑒定體系，對篩選西瓜枯萎病抗病種質(zhì)資源具有重要意義。西瓜枯萎病抗性鑒定及評(píng)價(jià)的常用方法有土壤接種法[11]、孢子懸浮液浸根接種法[12]、灌根接種法[13]、蘸胚根法[14]。其中，土壤接種法發(fā)病率較輕且不均勻；灌根法發(fā)病率低且不穩(wěn)定；蘸胚根法易操作但潛育期較長，一般為8～9 d；孢子懸浮液浸根接種法是目前西瓜枯萎病接種鑒定廣泛采用的一種方法，潛育期在4 d左右，而且發(fā)病率較高，在西瓜枯萎病材料的接種鑒定上取得顯著成效，但該法鑒定周期較長，易受到植株生長狀態(tài)及外部環(huán)境的影響，影響對品種抗性的客觀評(píng)價(jià)，資源評(píng)價(jià)成本較高，降低了抗性品種的選育效率。

本研究在傳統(tǒng)的孢子懸浮液浸根法的基礎(chǔ)上加以改良，采用西瓜?；图怄哏牭稐U菌生理小種2，對露白5 d后的西瓜幼苗的胚根進(jìn)行接種，接種5 d后觀察10份西瓜材料植株的生長狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)不同品種的發(fā)病率和病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)對西瓜種質(zhì)材料進(jìn)行抗病性鑒定評(píng)價(jià)，并利用DAB染色對該方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。與常規(guī)的枯萎病接種體系相比，此接種鑒定方法簡單，易操作，縮短了接種時(shí)間，且發(fā)病快，節(jié)省時(shí)間和空間成本。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用病原菌為西瓜?；图怄哏牭稐U菌2號(hào)生理小種，由本實(shí)驗(yàn)室保存。所用接種材料為浙江省農(nóng)科院蔬菜所西瓜研究室搜集的10份西瓜種質(zhì)材料，分別為Ford hook、PI288317、PI368509、PI536457、冬瓜皮、PI278038、PI279460、Sun sweet、廣二和慶久。分別將10份材料的種子去皮，在10%NaClO中消毒15 min，無菌水中潤洗3次，每次5 min，用濾紙吸去多余水分，將消毒后的種子置于透明塑料盒中，在塑料盒底部放入兩層濾紙，并加入無菌水使其完全濕潤，倒掉多余水分，置于溫度為25 ℃、濕度為90%、光周期為16 h/8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d，待植株兩片子葉完全展開轉(zhuǎn)綠時(shí)，準(zhǔn)備進(jìn)行枯萎病病菌的接種。

1.2 尖孢鐮刀桿菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的配置

液體PDA培養(yǎng)基配制。取馬鈴薯葡萄糖肉湯25 g，加入1 L蒸餾水，攪拌至完全溶解，校正pH為5.4。分裝至500 mL三角瓶中，每瓶200 mL，置于121 ℃高壓滅菌鍋滅菌15 min，冷卻后備用。

固體PDA培養(yǎng)基配制。稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂46 g，加入1 L蒸餾水，加熱攪拌至完全溶解，校正pH為6.0。置于121 ℃高壓滅菌鍋滅菌15 min，冷卻至45 ℃左右倒平板備用。

尖孢鐮刀桿菌培養(yǎng)。將-70 ℃冰箱保存的西瓜枯萎病2號(hào)生理小種轉(zhuǎn)到PDA固體培養(yǎng)基活化，菌絲生長較快，初期白色，隨后菌絲變?yōu)槊导t色，培養(yǎng)至菌絲長滿板時(shí)，在超凈工作臺(tái)上將菌絲轉(zhuǎn)移至200 mL PDA液體培養(yǎng)基中，置溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速200 r·min-1的搖床中培養(yǎng)12 h，使其產(chǎn)生大量孢子，將含孢子的PDA培養(yǎng)基用2層無菌紗布過濾，除去多余的雜質(zhì)，利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下將孢子懸浮液的濃度調(diào)整到1*107·mL-1，用于接種鑒定。

1.3 枯萎病接種

將生長5 d的西瓜幼苗的胚根完全浸沒在上述配置的枯萎病菌孢子懸浮液中，5 min后取出，用滅菌濾紙吸干根表多余菌液，再用無菌水將根洗干凈，放回塑料盒中，將塑料盒放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.4 病情嚴(yán)重度統(tǒng)計(jì)和病指計(jì)算方法

病情嚴(yán)重度分為4級(jí)。0級(jí)，植株未發(fā)病，長勢正常；1級(jí)，植株發(fā)病較輕，少量須根顏色變?yōu)闇\褐色；2級(jí)，葉片輕度萎蔫，大部分須根顏色發(fā)褐；3級(jí)，葉片萎蔫，主根和須根顏色均發(fā)褐。具體如圖1所示。計(jì)算病情指數(shù)[15]。

圖1 病情嚴(yán)重度分級(jí)情況

1.5 抗性調(diào)查評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

植株發(fā)病率是病害調(diào)查時(shí)抗性鑒定的重要指標(biāo)。根據(jù)幼苗根部褐色及葉片萎蔫程度進(jìn)行人工評(píng)價(jià)和分級(jí)?？剐苑旨?jí)按國際標(biāo)準(zhǔn)分成4個(gè)等級(jí)：高抗，病情指數(shù)<20；中抗，病情指數(shù)21～50；低抗，病情指數(shù)51～80；感病，病情指數(shù)81～100。利用Excel軟件對發(fā)病率、病情指數(shù)和抗性評(píng)價(jià)等級(jí)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)。

1.6 西瓜幼苗的DAB染色

聯(lián)苯胺染色法DAB(diaminobenzidine)是常用的抗病評(píng)價(jià)指標(biāo)，可檢測病原菌誘導(dǎo)后H2O2的積累水平。植物被病原菌侵染后，自身防御系統(tǒng)啟動(dòng)，初期會(huì)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，其主要成分為H2O2；在過氧化物酶作用下，DAB可與H2O2結(jié)合形成紅褐色聚合物。

DAB染液的配置。10 mM Tris-HCl 9 mL、3%(m/V) CoCl21 mL、DAB，顯色時(shí)加入H2O25～10 mL混勻后立即使用。具體操作方法為：將接種枯萎病菌5 d的西瓜幼苗整株浸入1 mg·mL-1DAB染液中，25 ℃及光照下放置2 h，然后轉(zhuǎn)至95%乙醇中煮沸15 min，對幼苗進(jìn)行充分脫色，觀察植株各部位是否出現(xiàn)紅褐色，并進(jìn)行觀察拍照、抗性評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜枯萎病菌的生長狀態(tài)

由圖2可見，將西瓜尖孢鐮刀桿菌2號(hào)生理小種的病菌接種到PDA固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d后，菌落顏色由中心至邊緣變?yōu)樽霞t色。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分生孢子為無色，單孢為卵圓或桿狀。

A—正面菌落形態(tài)；B—反面菌落形態(tài)；C—顯微鏡下孢子形態(tài)。圖2 西瓜枯萎病2號(hào)生理小種的菌落表型 及孢子形態(tài)

2.2 西瓜種質(zhì)抗病性

采用浸根法對西瓜5 d苗齡的幼苗進(jìn)行枯萎病菌接種，5 d后調(diào)查發(fā)病情況。結(jié)合病情指數(shù)對10份西瓜種質(zhì)的枯萎病抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)。表1顯示，10份西瓜種質(zhì)材料的抗性存在較大差異，發(fā)病率19.9%～98.5%，病情指數(shù)16.7～94.4。其中，對西瓜枯萎病2號(hào)生理小種表現(xiàn)高抗的材料為1份(Ford hook)，發(fā)病率19.9%，病情指數(shù)16.7；表現(xiàn)為中抗的材料有3份，包括PI288317、PI368509、PI536457，發(fā)病率29.1%～44.9%，病情指數(shù)38.9～41.7；表現(xiàn)為低抗的材料有4個(gè)，包括PI279460、PI278038、Sun sweet、冬瓜皮，發(fā)病率67.7%～79.2%，病情指數(shù)69.4～75.0；表現(xiàn)為感病的材料有2個(gè)，為廣二和慶久，發(fā)病率分別為96.3%和98.5%，病情指數(shù)分別是91.8和94.4。

2.3 西瓜幼苗的DAB染色

ROS迸發(fā)是植物應(yīng)答病原菌的早期防衛(wèi)反應(yīng)之一。當(dāng)病原菌入侵植物時(shí)，會(huì)引起ROS迸發(fā)，加速體內(nèi)ROS的積累[16]。研究表明，ROS的代謝與植物的抗病性有關(guān)，即ROS參與了植物與病原物互作體系中的許多關(guān)鍵過程，包括抗菌作用[17]、細(xì)胞壁強(qiáng)化[18]、植保素合成[19]、抗病信號(hào)傳導(dǎo)[20]和過敏性細(xì)胞死亡[21]等。利用DAB染色并通過褐色沉積反應(yīng)可檢測植物體內(nèi)ROS的積累情況，在一定程度上反映品種的抗病性。本研究對接種5 d后的西瓜幼苗進(jìn)行DAB染色，來驗(yàn)證本研究鑒定方法的結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同植株的褐色沉積程度與其枯萎病抗性呈負(fù)相關(guān)。由圖3可知，抗病材料Ford hook的植株褐色沉積最淺，感病材料廣二和慶久的植株褐色沉積最深。以上結(jié)果表明，西瓜品種對枯萎病的抗性越強(qiáng)，其DAB染色顏色越淺；反之，西瓜品種對枯萎病的抗性越弱，其DAB染色顏色越深。DAB染色的結(jié)果與胚根接種結(jié)合人工鑒定的結(jié)果相吻合，說明本研究建立的西瓜枯萎病抗性的胚根接種鑒定方法切實(shí)可行。

表1 幼苗接種西瓜枯萎病抗性鑒定結(jié)果

A～J為10份西瓜的編號(hào)。圖3 西瓜10份種質(zhì)材料接種5 d后DAB染色情況

3 小結(jié)

為使育種工作者能夠快速準(zhǔn)確的篩選到抗病材料，以便進(jìn)行后續(xù)研究，枯萎病抗性鑒定是西瓜抗病育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究在傳統(tǒng)浸根法的基礎(chǔ)上加以改良，對10份西瓜種質(zhì)材料進(jìn)行胚根接種，鑒定出1個(gè)高抗種質(zhì)(Ford hook)和3個(gè)中抗的西瓜種質(zhì)(PI288317、PI368509、PI536457)，為選育抗病、優(yōu)質(zhì)的西瓜品種提供了材料基礎(chǔ)。