楊艷， 李嘉彥， 周欣， 田歆， 高愛莉， 熊斯穎， 李薇， 陳曉吟， 劉玉梅, 朱慧蘭

(廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510095)

特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種慢性免疫異常性皮膚病,也是臨床上常見的過敏性皮膚病，其發(fā)病機制與趨化因子存在密切關(guān)系，趨化因子與靶細胞上相應受體特異性結(jié)合是各種免疫細胞完成炎癥反應中的組織定位、浸潤、再循環(huán)和歸巢等效應的分子基礎(chǔ)。窄譜中波紫外線(narrowband-UVB,NB-UVB)具有生物活性較強、不良反應較少、患者依從性好等特點,已在臨床上得到了較為廣泛的應用，但其作用于特應性皮炎的機理還不清楚。吡美莫司乳膏為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑,具有免疫抑制作用。本研究檢測NB-UVB聯(lián)合吡美莫司乳膏治療特應性皮炎前后，患者外周血嗜酸性粒細胞相關(guān)趨化因子eotaxin及其受體 CCR3的變化，以了解其治療機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

30例成人型中重度AD患者來自于2019年5-12月本所皮膚科門診，其中男16例,女14例;年齡18～53歲，平均(27.97±9.37)歲;病程1～32年，平均(19.83±8.03)年。納入標準：①符合特應性皮炎的診斷標準[1];②無嚴重心、肝、腎及其他臟器疾??；③治療前3個月內(nèi)未接受過任何光療;④治療前3個月內(nèi)全身或局部未使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑。排除妊娠、哺乳及光敏感等特殊情況。本研究中患者均已簽署知情同意書，研究通過倫理審批(批件號：201715)。

1.2 儀器與試劑

儀器：UV 100 L型紫外線照射儀(德國沃曼公司), 波長310～315 nm, 峰值為311 nm；BD FACSCalibur流式細胞分析儀(美國BD公司)。試劑：鼠抗人CCR3-FITC 及同型對照(美國R&D公司)；人 eotaxin 定量 EIA 試劑盒(上海森雄科技實業(yè)公司)。

1.3 標本采集和處理

清晨空腹抽取所有研究對象肘靜脈血10 mL，經(jīng)肝素200 U抗凝，采用Ficoll 密度梯度離心法分離PBMC及細胞收集與培養(yǎng)。

1.4 治療方法

采用 NB-UVB照射,每周3次，連續(xù)照射3個月。NB-UVB照射方法: 以照射儀附帶的最小紅斑量(minimal erythema dose,MED)測試附件測定患者皮膚(前臂)MED為參考劑量。 再根據(jù)此參考劑量減20%作為初始照射劑量, 平均為0.6 J/cm2, 治療后再根據(jù)患者皮膚反應程度調(diào)整照射劑量。一般在前次照射后無紅斑反應的前提下,每次增加照射劑量20%, 最大照射劑量為3.4 J/cm2。治療時患者需配戴UV防護眼鏡,接受全身照射者須穿短褲以保護生殖器部位。

治療期間患者早晚一次全身均勻涂抹一薄層維生素E乳膏保濕，在醫(yī)生明確診斷為AD部位上外用吡美莫司乳膏(1%濃度，每日2次，治療3個月)。

1.5 療效評價

采用歐洲SCORAD評分系統(tǒng)[2],對AD皮損及臨床嚴重程度進行評估。采用視覺模擬尺度(visual analogue scale，VAS)評分法對瘙癢程度進行評價。于治療前和治療結(jié)束后記錄SCORAD分值及VAS分值, 評價療效。評分由同一位醫(yī)師專門負責。

1.6 ELISA檢測AD患者血清中eotaxin水平

采用雙抗體夾心法， 操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.7 熒光抗體標記及流式細胞儀檢測PBMC中CCR3水平

在指標管中加入 10 μL CCR4-FITC 試劑， 然后在檢測管中分別加入 100 μL 抗凝血，并設(shè)立同型對照管， 振蕩混勻，室溫避光孵育20 min；加入2 mL的溶血素，振蕩混勻，室溫避光5 min，然后1 000 r/min離心5 min，棄上清液;加入PBS 2 mL，再1 000 r/min離心5 min，棄上清液;加入PBS 300 μL混勻。應用BD FACSCalibur流式細胞分析儀上機檢測。應用CellQuest軟件，分別以FSC/SSC給細胞設(shè)門，獲取門內(nèi)10 000個細胞/每管，分析CCR3表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 治療前后患者SCORAD、VAS分值變化

治療過程中無脫落病例。治療后患者的SCORAD及VAS分值均較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。詳見表1。

表1 AD患者治療前后SCORAD、VAS分值比較Tab.1 Comparison of SCORAD and VAS prior to and after treatment among the

2.2 AD患者eotaxin水平及PBMC中CCR3表達水平比較

患者血清eotaxin水平治療后明顯下降，與治療前比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.20，P<0.01)。治療后患者PBMC產(chǎn)生的CCR3表達水平亦明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.59,P<0.01)。詳見表2。

表2 AD患者治療前后PBMC產(chǎn)生eotaxin水平及CCR3表達的比較Tab.2 Comparison of the expression levels of eotaxin and CCR3 prior to and after treatment among the

3 討論

目前大量研究證實,嗜酸性粒細胞是特應性皮炎發(fā)病機制中的一個關(guān)鍵效應細胞，遲發(fā)相變態(tài)反應的持續(xù)因子。嗜酸性粒細胞在局部皮損中的浸潤與CC型趨化因子有密切的關(guān)系。趨化性細胞因子與靶細胞上相應趨化因子受體特異性結(jié)合是各種免疫細胞完成炎癥反應中的組織定位、浸潤、再循環(huán)和歸巢等效應的分子基礎(chǔ)[3]。

eotaxin是 CC 型化學趨化因子家族的成員，一種嗜酸性粒細胞(Eos)選擇性的β-趨化劑，正在成為治療過敏性疾病的重要標靶。eotaxin 趨化嗜酸性粒細胞到反應部位并促使它們分泌大量的毒性成分: 嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、 嗜酸性粒細胞衍生的神經(jīng)、嗜酸性粒細胞堿性蛋白和嗜酸性粒細胞過氧化物酶，這些物質(zhì)可引起皮膚的組織損傷和瘙癢，從而表現(xiàn)為特應性皮炎的一系列臨床癥狀。 體內(nèi)外的實驗均證實， 在抗原刺激下， 組胺可以增強內(nèi)皮細胞表面eotaxin的表達，并且可以提高嗜酸性粒細胞的黏附能力以及從微血管中遷移至組織的能力[4]。體外實驗亦證實，嗜酸性粒細胞可遷移和通過重組的人型血管內(nèi)皮黏附分子-1 預先涂鋪過的濾紙，而eotaxin能明顯增強嗜酸性粒細胞的這種遷移能力[5]。有學者發(fā)現(xiàn)eotaxin可以引起局部嗜酸性粒細胞的增多，而且呈時間和劑量的依賴性，同時伴隨肥大細胞脫顆粒的加強和組胺釋放的增加[6-7]。選擇性的CCR3拮抗劑的應用可明顯抑制eotaxin 所致的嗜酸性粒細胞的趨化募集，而更為重要的一點是，遲發(fā)相變態(tài)反應中的嗜酸性粒細胞的募集也同樣得到了抑制[8-9]。而國內(nèi)胡南等[10]已經(jīng)證實eotaxin在AD患者外周血表達增強。

NB-UVB 照射通過抑制嗜酸性粒細胞在細胞趨化與活化抑制細胞因子合成而起到治療特應性皮炎作用,治療成人及兒童AD 患者具有療效好、安全、光毒反應輕且不增加光照后皮膚癌發(fā)生率等優(yōu)點,是中、重度AD 的一線光療法[11]。Dayal等[12]在一項NB-UVB治療的長期安全性的研究中，對30例4～14歲的兒童AD患者采用NB-UVB治療，每周2次，很多患兒在第6次照射時SCORAD和VAS分值明顯下降，第24次治療后分值下降更為明顯，在停止照射后的第2年上述分值仍維持較低水平，未見反復及不良反應，取得了良好的療效。

外用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑 (topical calcineurin inhibitors，TCIS)包括他克莫司和吡美莫司，其唯一被批準使用的適應癥是AD。吡美莫司(pimecrolimus)是由鏈霉菌Streptomyceshygroscopicusvarascomycetes產(chǎn)生的子囊霉素巨內(nèi)酰胺的衍生物，其外用制劑為 1%乳膏。吡美莫司選擇性地抑制前炎癥細胞因子的產(chǎn)生和釋放，與FKBP-12有高親和性，在基因轉(zhuǎn)錄水平阻斷淋巴細胞的細胞因子合成，下調(diào) Th1(IL-2、INF-γ)以及Th2 (IL-4/IL-5/IL-10)的合成；研究證實吡美莫司可選擇性作用于皮膚的肥大細胞以及T淋巴細胞，但不影響成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞及內(nèi)皮細胞系，不誘導細胞凋亡，且經(jīng)皮膚吸收少，具有較強抗炎活性，但不具有糖皮質(zhì)激素的副作用[13-16]。大量短期臨床研究均已證實吡美莫司外用治療成人和兒童AD安全有效[17]，大規(guī)模長期臨床觀察以及藥代動力學研究也進一步證實了 TCIs 的臨床有效性和安全性[18]。

大量文獻證實窄譜中波紫外線或吡美莫司乳膏治療AD的療效較佳，但具體作用機制不明，以往的文獻也已證實正常人外周血血清中eotaxin水平遠低于AD組[19-21]。目前國內(nèi)外就窄譜中波紫外線聯(lián)合吡美莫司乳膏治療成人型AD的療效較少。本研究結(jié)果顯示，窄譜中波紫外線聯(lián)合吡美莫司乳膏治療成人型AD患者后,SCORAD和VAS評分明顯降低，且PBMC產(chǎn)生的eotaxin含量及受體CCR3明顯下降，提示聯(lián)合治療可能通過降低eotaxin和CCR3表達，從而減少嗜酸性粒細胞的募集和活化，并進一步減少炎性介質(zhì)和毒性蛋白的釋放，達到減輕特應性皮炎患者組織損傷和皮膚瘙癢的目的。

綜上所述，窄譜中波紫外線聯(lián)合吡美莫司乳膏治療成人型AD安全、有效，作用可能是通過降低eotaxin和CCR3的表達這一途徑來實現(xiàn)，但本研究樣本量較小，需在下一步行大樣本研究證實，以供臨床醫(yī)生參考。