蘇攀峰，唐慶九，陳 盛，趙立彬，王玉蘭，劉艷芳，周 帥*，許劍鋒

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403；2上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306；3上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306；4湖南炎帝生物工程有限公司，株洲 412000)

葛仙米(Nostocsphaeroidskützing)在我國(guó)歷史悠久，是一種藥食同源的植物[1]，屬于藍(lán)藻門念珠藻科[2-4]。葛仙米的營(yíng)養(yǎng)成分豐富，蛋白質(zhì)、氨基酸、VC、VE和β-胡蘿卜素含量高，同時(shí)還富含具有生物活性的多糖[5]。研究發(fā)現(xiàn)葛仙米多糖由葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等多種單糖組成，具有抗腫瘤、抗凝血與抗菌等作用[6-8]。

蒽酮比色法和苯酚-硫酸法是多糖含量測(cè)定的常用方法[9]，測(cè)定結(jié)果為多糖的總量，而HPLC法[10-11]可以分析特定分子量多糖的含量，更好地表征葛仙米多糖的特性。前期研究發(fā)現(xiàn)葛仙米多糖的HPLC分子量分布圖譜中主要為大分子量多糖，且該多糖部分沒有蛋白和核酸的吸收，因此可以運(yùn)用HPLC對(duì)葛仙米中大分子量多糖進(jìn)行定量分析。本研究采用高效液相色譜方法，用示差折光檢測(cè)器和多角度激光光散射檢測(cè)器，0.2molL的鹽溶液做流動(dòng)相，以分離純化的葛仙米多糖為標(biāo)準(zhǔn)品，建立一套高效液相色譜快速、準(zhǔn)確直接測(cè)定葛仙米中大分子量多糖含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛仙米由湖南炎帝生物工程有限公司提供，海藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，三氟乙酸(TFA)購(gòu)于Merck公司，重蒸酚、濃硫酸、氫氧化鈉等均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純。

AG 22331高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；FA2004N分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；HWS12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DC-2006低溫恒溫槽(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(Thermo Savant公司)；Waters2695型高效液相色譜儀及Empower色譜工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó) Waters 公司)；ELGA PURELAB Ultra 超純水儀(威立雅水處理技術(shù)有限公司)；小型粉碎機(jī)(上海淀九中藥機(jī)械制造有限公司)；ICS-2500型高效離子色譜儀(Dionex公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取葛仙米粉末于容量瓶中，加入500倍體積的蒸餾水，100℃水浴2h，離心(9 000g，15min)，上清液濃縮至原體積的110，加入無(wú)水乙醇醇沉，使乙醇體積濃度達(dá)到40%，4℃過夜，離心收集沉淀，用體積濃度為45%乙醇醇洗4次；將醇洗后的沉淀溶解在10倍體積的蒸餾水中，加入無(wú)水乙醇醇沉，使乙醇體積濃度達(dá)到40%，4℃過夜，離心收集沉淀，用體積濃度為45%乙醇醇洗2次；冷凍干燥獲得大分子葛仙米多糖純品，經(jīng)苯酚-硫酸法[12-13]檢測(cè)多糖含量為97.9%，HPLC檢測(cè)為均一對(duì)稱峰，因此可作為葛仙米多糖標(biāo)準(zhǔn)品。精密取葛仙米多糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于10 mL容量瓶中，加入超純水溶解定容，搖勻待用。

1.2.2 柱型的選擇

稱取標(biāo)準(zhǔn)品3.0 mg，加入1 mL流動(dòng)相，充分溶解，離心，上清液經(jīng)0.22 μm的水相微孔膜過濾后進(jìn)行HPSEC-MALLS-RI分析，選擇TSKgel G6000 PWXL、TSKgel G6000 PWXL與TSKgel G4000 PWXL串聯(lián)進(jìn)行比較，選擇合適的柱型。

1.2.3 多糖含量測(cè)定

將經(jīng)過預(yù)處理的葛仙米多糖提取液按標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定條件測(cè)出峰面積。根據(jù)線性方程和以下公式算出葛仙米多糖的含量。

(1)

其中，D為根據(jù)線性方程算出葛仙米多糖的質(zhì)量體積比(mgmL)，M是原料質(zhì)量體積比(mgmL)。

色譜條件[14-15]：Waters 2695 HPLC 系統(tǒng)配備UV檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器(RI)、多角度激光光散射檢測(cè)器(MALLS)，TSKgel G6000 PWXL、TSKgel G4000 PWXL(7.8 mm×30 cm)，流動(dòng)相為0.15 molL NaNO3、0.05 molL NaH2PO4(pH=7、0.02%的N3Na)，柱溫30 ℃，流速0.5 mLmin，使用Astra(version 6.1.1，Wyatt Technology，Santa Barbara，CA)數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)光散射數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析，折光指數(shù)增量dndc=0.146 mLg。

1.2.4 葛仙米水溶性多糖提取條件的單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 加熱時(shí)間的選擇

1.2.4.2 加熱溫度的選擇

1.2.4.3 料液比的選擇

1.2.5 葛仙米水溶性多糖提取條件的正交試驗(yàn)

為確定提取葛仙米水溶性多糖的最優(yōu)提取條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行了3因素3水平正交試驗(yàn)，采用L9(34)正交表(表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

正交試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取葛仙米各 100.0 mg置于具塞三角瓶中，按照‘1.2.5’試驗(yàn)所確定的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)，按‘1.2.3’的方法計(jì)算多糖含量。

1.2.6 方法學(xué)考察

1.2.6.1 精密度考察

1.2.6.2 重現(xiàn)性考察

1.2.6.3 穩(wěn)定性考察

1.2.6.4 加樣回收率考察

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有單因素試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為其平均值。對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，P≤0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛仙米多糖的HPLC圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別對(duì)不同的多糖色譜柱進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)TSK-Gel G6000 PWXL分離效果較好，用該色譜條件的葛仙米多糖標(biāo)準(zhǔn)品和葛仙米的HPLC如圖1所示，樣品的色譜峰與其他成分有效分離，該峰在波長(zhǎng)280 nm和260 nm基本無(wú)紫外吸收，因此該出峰時(shí)間段沒有蛋白和核酸的干擾，可以進(jìn)行多糖的HPLC分析定量。

以醇沉的葛仙米多糖為標(biāo)準(zhǔn)品，在0.015 625—5.0 mgmL內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程Y=1 995 695.548X-170.597(R2=0.999)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性關(guān)系，定量上限為10 mgmL、下限為0.078 625 mgmL。

2.2 葛仙米多糖提取條件的單因素結(jié)果分析

葛仙米多糖如何能被充分提取出來(lái)，對(duì)影響因素進(jìn)行分析的結(jié)果如圖2。隨著加熱時(shí)間的增加，多糖含量逐漸升高，大于5h以后無(wú)顯著差異。溫度對(duì)多糖的提取影響較大，溫度越高，多糖含量增加；因此最適合的溫度為100℃。料液比為1∶50—1∶500時(shí)，多糖含量隨著料液比的增加而提高，因此選擇料液比為1∶500。

2.3 葛仙米水溶性多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

表2中的極差值大小可以看出，RA>RB>RC，影響因素的順序?yàn)闇囟?時(shí)間>料液比。由均值大小可知，最優(yōu)試驗(yàn)方案為：溫度100 ℃、時(shí)間5 h、料液比為1∶500。在 A3B3C2條件下進(jìn)行葛仙米水溶性多糖提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖含量為47.01%，接近于表2正交試驗(yàn)結(jié)果47.68%，可驗(yàn)證采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化葛仙米水溶性多糖的提取工藝是可行的。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性考察

按照‘1.2.6.1—1.2.6.3’進(jìn)行試驗(yàn)，表3結(jié)果表明：儀器精密度良好；重現(xiàn)性和穩(wěn)定性的RSD值分別為1.13%、2.56%，HPLC測(cè)定方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，符合試驗(yàn)要求。

表3 精密度、重現(xiàn)性、顯色穩(wěn)定性的考察結(jié)果

2.4.3 加樣回收率考察

如表4所示，較小的RSD值顯示試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度較大；加樣回收率均超過96%，表明加樣回收率高，測(cè)定值能夠反映實(shí)際值。

表4 加樣回收率結(jié)果

3 結(jié)論

HPLC法測(cè)定葛仙米多糖與苯酚硫酸法相比，優(yōu)勢(shì)在于可以測(cè)定特定分子量范圍的多糖。該方法可以在大分子量多糖無(wú)蛋白和核酸干擾的情況下使用，能更加準(zhǔn)確地定量。HPLC法測(cè)定大分子量多糖和苯酚硫酸法測(cè)定總糖這兩種方法進(jìn)行結(jié)合可以更好地表征葛仙米多糖的特征。

按照優(yōu)化條件對(duì)葛仙米水溶性多糖進(jìn)行水提，采用苯酚-硫酸法測(cè)得的總糖為32.6%，從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，采用HPLC法測(cè)定葛仙米多糖含量更高，為47%左右。這兩個(gè)結(jié)果比較矛盾，分析其原因，主要是由于苯酚硫酸法測(cè)定所用的標(biāo)準(zhǔn)品為葡萄糖，而葛仙米多糖的單糖組成有甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和葡萄糖醛酸，同樣濃度時(shí)半乳糖、葡萄糖醛酸會(huì)比葡萄糖的吸光度低，導(dǎo)致多糖含量被低估。根據(jù)甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸其物質(zhì)的量的比(1.00∶1.92∶0.97∶1.02∶0.91)配制混合標(biāo)準(zhǔn)品，再進(jìn)行測(cè)定，運(yùn)用優(yōu)化的方法進(jìn)行提取分析，發(fā)現(xiàn)葛仙米多糖含量為48.13%。這個(gè)方法的多糖測(cè)定也發(fā)現(xiàn)葛仙米中主要含有的是大分量多糖。

因此，運(yùn)用HPLC測(cè)定葛仙米水溶性多糖含量的方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法精密度高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，適用于葛仙米水溶性多糖含量的測(cè)定分析，為葛仙米水溶性多糖含量的測(cè)定提供了可靠的方法和手段。