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        豬Delta冠狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查及M基因序列分析

        2020-03-25 08:46:30馬玉飛李本強程靖華劉惠莉
        上海農(nóng)業(yè)學(xué)報 2020年1期
        關(guān)鍵詞:毒株質(zhì)粒特異性

        馬玉飛,李本強,陶 潔,程靖華,劉 雷,劉惠莉*

        (1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海種豬工程技術(shù)研究中心,上海 201106;2 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心,上海 201306)

        豬Delta冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ-冠狀病毒屬(Deltacoronavirus),是一種新發(fā)現(xiàn)的單股正鏈RNA病毒,主要感染小腸,尤其是空腸末端和回腸,可引起嚴(yán)重的腸炎并伴有腹瀉、脫水等癥狀,臨床特征與豬流行性腹瀉(PED)和豬傳染性胃腸炎(TGE)相似,但該病毒可致哺乳期仔豬產(chǎn)生較高死亡率,給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Ma等[1]將分離到的PDCoV病毒接種新生仔豬,所有接種豬只均發(fā)生水樣腹瀉、嘔吐等流行性腹瀉樣癥狀。

        PDCoV基因組全長大約25 kb,是所有冠狀病毒中基因組最小的,其基因組成、排列與其他冠狀病毒相似,包括5’和3’非翻譯區(qū)以及7個開放閱讀框,編碼4 種主要的結(jié)構(gòu)蛋白:纖突(S)蛋白、囊膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白。研究表明,PDCoV 的M基因在不同毒株之間的同源性大于90%,與其他冠狀病毒M基因的同源性均小于50%[2]。PDCoV作為豬病毒性腹瀉的新病原,逐漸受到了關(guān)注,繼美國成功分離到2株P(guān)DCoV之后[3],陳建飛等[4]成功分離到了國內(nèi)首株P(guān)DCoV。但因很多腹瀉類病毒都主要感染小腸部位,運用傳統(tǒng)方法中的臨床剖檢和顯微鏡觀察很難將PDCoV與其他豬腹瀉病毒加以區(qū)分。本研究以PDCoV保守的M基因為擴(kuò)增目的片段,建立RT-PCR檢測方法,并對臨床PDCoV感染情況進(jìn)行監(jiān)測分析,為了解PDCoV在豬腹瀉疫病中的作用提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 樣品與病毒

        2015—2017年從上海及周邊豬場采集518份有腹瀉癥狀豬的糞便樣品。

        豬流感病毒(SIV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬輪狀病毒(PoRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)及大腸桿菌(E.coli)由本實驗室保存。

        1.2 主要試劑

        M-MLV RNA聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、500 bp DNA Maker、pMD-18T載體等PCR試劑均購自TaKaRa公司(日本);DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室提供。質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司。

        1.3 引物設(shè)計

        根據(jù)GenBank中已發(fā)表PDCoV 毒株的M基因序列,應(yīng)用DNASTAR和Oligo 7軟件針對M基因保守序列區(qū)域設(shè)計1對特異性引物,此外,根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6],設(shè)計并合成豬嵴病毒(PKV)、豬星狀病毒(PAstV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)的檢測引物(表1)。引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

        表1 引物序列

        1.4 臨床樣品的處理與總RNA的提取

        將糞便樣品用PBS按照1∶5比例稀釋,震蕩混勻,靜置10 min,取250 μL上清液與750 μL Trizol裂解液,震蕩混合,冰浴靜置10 min;加入200 μL三氯甲烷,震蕩混勻,冰浴靜置5 min,4 ℃ 12 000 rmin離心15 min;吸取上清,加入等體積的異丙醇,-20 ℃沉淀15 min;4℃ 12 000 rmin離心15 min;棄上清,加入1 mL 75%乙醇洗滌;4℃ 12 000 rmin離心15 min,棄上清并吹干;用20 μL無RNase DEPC水溶解RNA,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 反轉(zhuǎn)錄

        取10 μL RNA,2 μL primer mix,1 μL M-MLV,1 μL RNase inhibitor,4 μL 5×RT M-MLV Buffer,2 μL dNTP,混勻。反應(yīng)程序:42 ℃ 1 h;75 ℃ 15 min;4 ℃ 1 h。制備的cDNA模板-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.6 RT-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

        取2 μL cDNA,2.5 μL 10×PCR Buffer,1.5 μL dNTP,0.5 μL Taq酶,上、下引物各0.4 μL,超純水補至25 μL。反應(yīng)程序:94 ℃,4 min;94 ℃,30 s;X ℃,30 s;72 ℃,30 s,30個循環(huán);72 ℃,10 min;4 ℃保存。設(shè)置7個退火溫度(X),分別是:49 ℃、51 ℃、53 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

        1.7 陽性質(zhì)粒的制備

        將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,連接pMD-18T載體,16 ℃作用30 min,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂板。挑取平板上單個菌落進(jìn)行搖菌,菌液PCR進(jìn)行鑒定,將疑似陽性菌液送公司測序,待序列正確后,將相對應(yīng)的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.8 RT-PCR方法的特異性檢測

        以SIV、CSFV、PoRV、PEDV、TGEV、大腸桿菌(E.coli)反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為模板,以無菌水為陰性對照,利用優(yōu)化后的擴(kuò)增體系進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,檢測該方法的特異性。

        1.9 RT-PCR方法的敏感性測定

        利用 pMD-18T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,測定其濃度并計算拷貝數(shù)。進(jìn)一步將構(gòu)建的重組質(zhì)粒按照10-1、10-2、10-3……10-10,進(jìn)行10倍倍比稀釋,以不同稀釋度的重組質(zhì)粒為模板,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,測定該方法的敏感性。

        1.10 臨床樣品的檢測

        利用建立的RT-PCR方法對2015—2017年從上海周邊豬場采集的518份豬腹瀉糞便樣品進(jìn)行PDCoV病原檢測。同時,利用其他相關(guān)豬腹瀉病毒引物(PKV、PAstV、PEDV、TEGV)對PDCoV陽性樣本進(jìn)行檢測,以了解PDCoV病原與其他豬腹瀉病毒的混合感染情況。

        1.11 M基因的遺傳進(jìn)化分析

        運用DNAstar軟件將測序獲得的10份陽性毒株的核酸序列與GenBank中公布的PDCoVM基因序列進(jìn)行比對分析,并繪制遺傳進(jìn)化樹。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 RT-PCR檢測方法的建立

        以腹瀉糞便樣品提取的總RNA為模板,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,獲得與目的片段大小一致的條帶,約為281 bp(圖1),且無非特異性擴(kuò)增,測序表明所擴(kuò)增的產(chǎn)物為PDCoV基因片段。

        2.2 RT-PCR最佳退火溫度的確定

        RT-PCR結(jié)果顯示,Tm在49—61℃時能夠特異性的擴(kuò)增出目的條帶,當(dāng)Tm為53 ℃時所得到的條帶相對較亮,故53 ℃為最佳退火溫度(圖2)。

        2.3 RT-PCR靈敏度的確定

        將制備的陽性質(zhì)粒(3.92 x1010copiesμL)10倍倍比稀釋后,分別進(jìn)行RT-PCR試驗,如圖3所示,RT-PCR檢測PDCoV靈敏度的最低拷貝數(shù)為3.92 x103copiesμL。

        2.4 RT-PCR特異性分析

        如圖4所示,相同條件下,以SIV、CSFV、PoRV、PEDV、TGEV、大腸桿菌(E.coli)和H2O為模板,未能擴(kuò)增出條帶,而以PDCoV為模版能擴(kuò)增出特異性目的條帶,說明建立的方法特異性強,與其他病原無交叉反應(yīng)。

        2.5 臨床樣品檢測

        利用本研究建立的RT-PCR方法對518份豬腹瀉樣品進(jìn)行PDCoV檢測,結(jié)果顯示25份樣品為陽性,測序證實均為PDCoV,該方法陽性檢出率為4.8%。在所檢出的陽性樣本中,PKV和PAstV與PDCoV的混合感染率分別為40%和48%;PDCoV與PEDV混合感染率為8.0%,未檢測到PDCoV與TEGV混合感染的樣本。

        2.6 PDCoV M基因的遺傳進(jìn)化分析

        利用Mega6.0軟件對10株上海地區(qū)流行毒株P(guān)DCoV的M基因進(jìn)行基因序列的遺傳進(jìn)化分析和同源性比對發(fā)現(xiàn),上海地區(qū)流行毒株的M基因間的同源性為95%—99.6%(圖5)。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn),它們與國內(nèi)PDCoVM基因參考序列的同源性為96.8%—100%,其中FM-1與四川株(S27-2012)和湖北株(CHN-JS-2014)的核酸同源性為100%。

        通過分析PDCoVM基因進(jìn)化樹得知,臨床檢測到的10株上海地區(qū)流行毒株(FM-1、FM-2、JD-1、JD-2、JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5、JS-6)的M基因序列與從GenBank中所選取得到PDCoVM基因(表2)參考序列屬于同一分支。這些序列與國內(nèi)報道的豬Delta冠狀病毒的親緣關(guān)系較近,而與國外的豬Delta冠狀病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。

        表2 M基因進(jìn)化樹參考毒株

        3 結(jié)論與討論

        PDCoV于2012年首次在香港的豬群中檢測到,相繼在美國、韓國流行[7]。2015年,董楠等[8]對湖北、江蘇、廣東、河南、安徽等地規(guī)?;i場的215 份糞便樣品進(jìn)行檢測,共檢測到14份PDCoV陽性樣品,陽性率為6.5%;彭艷伶等[9]對四川省涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中的PEDV、PDCoV和GARV進(jìn)行檢測,PDCoV檢出率高達(dá)33.33%;劉玲玲等[10]利用PDCoV和TGEV雙重RT-PCR檢測方法對河南各地市的252份樣品進(jìn)行檢測,PDCoV陽性率12.30%。本研究利用RT-PCR方法對2015—2017年上海周邊豬場的518份豬腹瀉樣品進(jìn)行PDCoV病原檢測,結(jié)果檢測出25份陽性樣品,陽性率為4.8%,表明PDCoV在腹瀉豬群中存在一定比例。PDCoV、PEDV 和TGEV 均屬于冠狀病毒,易發(fā)生混合感染,且它們感染所引起的臨床癥狀非常相似。 Jung 等[11]對美國俄亥俄州59 份豬腹瀉病料檢測顯示,PDCoV陽性率為29%,PEDV和PDCoV 的混合感染率為42.86%。本研究中,PEDV 和PDCoV 的混合感染率為8.0%,未檢測到PDCoV與TEGV混合感染的樣本;值得注意的是PKV和PAstV與PDCoV的混合感染率分別為40%和48%,表明PKV和PAstV對于PDCoV的致病力可能起協(xié)同或是加重作用。

        相比于其他豬冠狀病毒,PDCoV的檢測和診斷方法仍處在發(fā)展中階段[12]。目前,對于PDCoV病原的檢測方法主要包括病原學(xué)檢測和抗體檢測。RT-PCR技術(shù)憑借其便捷、靈敏度高、特異性強等特性已成為基因研究和分析的最常用方法之一。病原學(xué)檢測正是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)建立的檢測方法,Zhang等[13]利用豬Delta冠狀病毒的M基因建立了此病毒的多重RT-PCR和TaqMan qRT-PCR檢測方法。逢鳳嬌等[14]建立了PDCoV的RT-PCR檢測方法,PDCoV最低檢測限為6.33×104copiesμL。鄭蘭蘭等[15]利用熒光定量PCR技術(shù)建立了豬δ冠狀病毒的檢測方法。在抗體檢測方面,Thachil等[16]以S1蛋白和N蛋白作為包被抗原,建立了PDCoV抗體的間接ELISA檢測方法,并運用此方法對355份血清樣本進(jìn)行了檢測。

        本研究建立的RT-PCR方法,具有較好的靈敏性和較強的特異性,最低檢測限量可達(dá)3.92×103copiesμL,其靈敏度高于逢鳳嬌等[14]建立的方法。對擴(kuò)增的M基因同源性分析表明,10株上海地區(qū)流行毒株的M基因間的同源性達(dá)95.0%—99.6%,與GenBank登錄的其他PDCoVM基因序列同源性為96.1%—100%,說明本研究檢測到的PDCoV流行株之間遺傳差異較小,但仍需持續(xù)監(jiān)測。

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