朱麗慧，廖榮榮，閆春曉，丁百香，朱根生，吳 寧，楊長鎖*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，國家家禽工程技術(shù)研究中心，上海201106；2光明食品集團(tuán)上海海豐大豐禽業(yè)有限公司，上海 200085)

隨著國家對養(yǎng)殖場地的限制，在現(xiàn)代蛋雞養(yǎng)殖過程中，為了追求經(jīng)濟(jì)效益的最大化，我國規(guī)?；半u場多采用高密度層疊式飼養(yǎng)模式以提高飼養(yǎng)密度，隨之而來的是由于密度過高及夏季通風(fēng)不良造成大量雞群的熱應(yīng)激，進(jìn)而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。另外，現(xiàn)代規(guī)模化雞場一般采用濕簾降溫和負(fù)壓通風(fēng)系統(tǒng)以最大程度地降低雞舍內(nèi)溫度，但在設(shè)備安裝和雞舍設(shè)計(jì)上往往照搬國外經(jīng)驗(yàn)，造成嚴(yán)重水土不服，由于雞舍設(shè)計(jì)不合理，降溫效果十分有限，造成夏季雞群出現(xiàn)嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激反應(yīng)。2016年，課題組對本次研究的同一棟雞舍夏季熱應(yīng)激的經(jīng)濟(jì)損失情況進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)對于一棟10萬只蛋雞的高密度層疊式雞舍，整個(gè)夏季的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到1.5元人民幣只，且死亡雞群主要集中于雞舍末端[3]。已有研究顯示，血液承擔(dān)著機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，是調(diào)節(jié)機(jī)體代謝的主要途徑，血液生化指標(biāo)的變化可以反映機(jī)體組織器官的生理病理狀況，也是篩選疾病相關(guān)分子標(biāo)記物的理想材料[4]。基于此，本試驗(yàn)擬研究高密度層疊式籠養(yǎng)模式下熱應(yīng)激對雞舍內(nèi)不同位置以及不同籠層高度的高產(chǎn)蛋雞血漿生理生化指標(biāo)的影響，以評估現(xiàn)行集約化通風(fēng)降溫系統(tǒng)的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以光明食品集團(tuán)上海海豐大豐禽業(yè)有限公司的一棟層疊式籠養(yǎng)雞舍為研究對象。該雞舍為全密閉輕鋼結(jié)構(gòu)，雞舍籠具采用八層四列層疊式雞籠，呈四列五走道布置，每列并排設(shè)置2個(gè)雞籠，單個(gè)雞籠的尺寸為60cm×65cm×45.5cm(長×寬×高)，每籠內(nèi)飼養(yǎng)9只海蘭褐產(chǎn)蛋雞，籠底平均每羽占有面積為433cm2。每列雞籠長度107m，共計(jì)11 328個(gè)雞籠。整棟雞舍長128m，寬14m，檐高6.3m，內(nèi)屋脊高6.5m(雞舍天花板最高處)，自動(dòng)化環(huán)境控制系統(tǒng)選用美國僑太公司的控制系統(tǒng)，雞舍溫度濕度監(jiān)控布局見圖1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取雞舍正中一列雞作為本次試驗(yàn)的研究對象，將雞籠按照層數(shù)由下往上依次編號(hào)(圖2)，并將雞籠由前往后分成前端、中端、末端3個(gè)部位，每個(gè)部位選取5個(gè)雞籠，作為5個(gè)重復(fù)，每個(gè)雞籠9只雞，在適溫(2017年5月10日，雞舍平均溫度27.4℃，舍內(nèi)相對濕度48%—55%)和高溫(2017年7月19日，雞舍平均溫度31.8℃，相對濕度70%—80%)條件下，每個(gè)雞籠隨機(jī)抽取3只雞，利用肝素抗凝管真空采血，低溫低速離心機(jī)3 000rmin離心15min，收集血漿。試驗(yàn)期間使用美國僑太公司的全自動(dòng)環(huán)境控制系統(tǒng)檢測雞舍溫度，2017年7月份高溫時(shí)期雞舍的環(huán)境溫度均高于28℃，環(huán)境相對濕度在70%—80%。

1.3 血漿指標(biāo)的測定

測定蛋雞血漿中總膽固醇、甘油三酯、還原型谷胱甘肽(GSH)含量和總超氧化物歧化酶(SOD)活性，檢測試劑盒購自用南京建成生物工程研究所。血漿腫瘤壞死因子α(TNF-α)、皮質(zhì)醇、內(nèi)毒素以及熱應(yīng)激蛋白70(HSP70)水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，ELISA試劑盒購自上海生工生物科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用ELISAalc軟件進(jìn)行ELISA數(shù)據(jù)分析計(jì)算，擬合模型選用Logistic曲線(四參數(shù))。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用one-way-ANOVA進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan法(方差不齊的數(shù)據(jù)采用Dunnett T3法)。

表1 熱應(yīng)激前后不同籠層蛋雞血漿抗氧化能力變化

Table 1 Changes of plasma antioxidant capacity in layers of different cage layers before and after heat stress

注：同行數(shù)據(jù)后小寫字母相同或無字母表示差異不顯著(P> 0.05)，字母相鄰表示差異顯著(P< 0.05)，字母相間表示差異極顯著(P<0.01)；同列數(shù)據(jù)后大寫字母相鄰表示差異顯著(P< 0.05)，字母相同或無字母表示差異不顯著(P> 0.05)；下同

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激對蛋雞血漿抗氧化能力的影響

如表1所示，相較于適溫環(huán)境下，不同籠層高度的蛋雞血漿抗氧化酶活力在高溫環(huán)境(熱應(yīng)激)下均呈現(xiàn)極顯著下降趨勢。在適溫環(huán)境下，不同籠層高度的蛋雞血漿抗氧化酶SOD活力和GSH含量均無顯著差異；在高溫環(huán)境下，雞舍前端不同籠層雞群的血漿SOD活力和GSH含量之間無顯著差異，而雞舍中端上層籠位雞群的血漿SOD活力和GSH含量顯著低于下層籠位雞群，另外，籠層8雞群的血漿GSH含量顯著低于其他籠層雞群。

比較熱應(yīng)激狀態(tài)下不同雞舍位置雞群抗氧化能力發(fā)現(xiàn)(圖3)，在高溫環(huán)境下，雞舍前端(近濕簾位置)蛋雞的血漿SOD活力和GSH含量高于雞舍中端和末端雞群。其中，雞舍前端上層籠(5—8層籠)雞群的血漿SOD活力極顯著高于雞舍中端和末端雞群。雞舍前端籠層6和籠層7雞群的血漿GSH含量相對高于相同籠層高度雞舍中端和末端雞群。另外，籠層7位置雞舍中端雞群的血漿GSH含量顯著低于相同籠層高度雞舍前端和末端雞群。以上結(jié)果表明，熱應(yīng)激會(huì)顯著降低蛋雞的血漿抗氧化酶活性，對上層籠雞群的影響尤為顯著。

2.2 熱應(yīng)激對蛋雞血漿血脂水平的影響

與適溫環(huán)境相比，高溫環(huán)境下不同籠位雞群的血漿甘油三酯和總膽固醇含量均呈下降趨勢(表2)。其中，下層籠位雞群的血漿甘油三酯和總膽固醇含量在熱應(yīng)激環(huán)境下顯著低于適溫環(huán)境，如熱應(yīng)激環(huán)境下，雞舍前端籠層1、籠層2和籠層4 雞群的血漿甘油三酯含量分別下降了46.46%、23.25%和38.12%；雞舍中端籠層2、籠層3和籠層4雞群的血漿甘油三酯含量分別下降了26.61%、58.48%和41.76%；雞舍末端籠層1、籠層2 和籠層3雞群的血漿甘油三酯含量分別下降了25.20%、26.15%和70.23%；而上層籠位不同雞舍位置雞群的血漿甘油三酯含量在熱應(yīng)激后雖然呈現(xiàn)出下降趨勢，但差異不顯著。此外，雞舍前端籠層1—5，雞舍中端和末端的籠層1—4的雞群血漿總膽固醇相較于適溫狀況下的血漿總膽固醇含量顯著降低，最大下降70.33%。

表2 熱應(yīng)激前后雞舍內(nèi)不同層籠位蛋雞血漿血脂水平的變化

Table 2 Changes of plasma lipid in layers of different cage layers before and after heat stress

值得注意的是，在適溫環(huán)境下，不同雞舍位置的下層籠(籠層1—4)雞群的血漿總膽固醇含量顯著高于上層籠雞群，如雞舍前端籠層1雞群的血漿總膽固醇含量是籠層2雞群的3.88倍。在血漿甘油三酯含量方面，在高溫環(huán)境下，除了雞舍前端籠層1和末端籠層3雞群外，各籠層雞群的血漿甘油三酯含量無顯著差異。本試驗(yàn)中雞舍前端籠層1 和末端籠層3雞群的血漿甘油三酯含量顯著低于其他籠層，這可能與雞群承受的熱應(yīng)激狀況以及雞群個(gè)體差異相關(guān)。由此可見，高溫可導(dǎo)致高密度籠養(yǎng)雞群的血漿血脂水平降低，對血漿總膽固醇含量的影響較為顯著。

另外，比較高溫環(huán)境下雞舍不同位置雞群的血漿血脂水平發(fā)現(xiàn)(圖4)，相同籠層不同雞舍位置雞群的血漿甘油三酯和總膽固醇含量無明顯規(guī)律可循。在高溫環(huán)境下，位于雞舍中端底層籠層1雞群的血漿甘油三酯含量顯著高于前端和末端底層雞群，而位于中端底層籠層2和籠層3雞群的甘油三酯和總膽固醇含量低于相同籠層的雞舍前端和末端雞群，其他籠層不同雞舍位置雞群之間的血漿甘油三酯和總膽固醇含量無顯著差異。

2.3 熱應(yīng)激對蛋雞血漿TNF-α、皮質(zhì)醇、內(nèi)毒素和熱應(yīng)激蛋白含量的影響

基于以上血漿抗氧化酶活力和血脂水平的檢測結(jié)果，進(jìn)一步比較適溫和高溫環(huán)境下雞舍末端不同籠層雞群的血漿TNF-α、皮質(zhì)醇、內(nèi)毒素和HSP70含量的變化。如表3所示，在適溫環(huán)境下，雞舍末端不同籠層高度雞群的血漿TNF-α、皮質(zhì)醇、內(nèi)毒素和HSP70含量均無顯著差異；而在高溫環(huán)境下，熱應(yīng)激導(dǎo)致不同籠層雞群的血漿TNF-α、皮質(zhì)醇、內(nèi)毒素和HSP70含量均呈現(xiàn)不同程度的上升。上層籠雞群，尤其是頂層籠位雞群的血漿TNF-α、內(nèi)毒素和HSP70含量顯著增高，其中，籠層8雞群的血漿TNF-α和HSP70含量極顯著高于其他籠層雞群。

表3 不同層籠位蛋雞血漿TNF-α、內(nèi)毒素、皮質(zhì)醇和HSP70含量的變化

Table 3 Changes of TNF-α，cortisol，endotoxin and HSP70 in layers of different cage layers before and after heat stress

3 討論

3.1 熱應(yīng)激對蛋雞血漿抗氧化能力的影響

生物體中自由基的產(chǎn)生與物質(zhì)代謝之間維持著微妙的平衡關(guān)系，這種平衡也是生物體維持生物學(xué)功能的關(guān)鍵[5]。自由基作為第二信使參與某些生化反應(yīng)，但是由于自由基較為活躍，當(dāng)其產(chǎn)生量超過機(jī)體的清除能力，就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)而造成生物膜損傷、蛋白變性、DNA復(fù)制障礙等[6-8]。生物體在長期進(jìn)化過程中形成了一套完整的抗氧化系統(tǒng)用于清除自由基，其中抗氧化酶就是這一套抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分?？寡趸窼OD是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，它能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)。SOD具有多種同工酶，主要用作生物標(biāo)志物診斷分析環(huán)境應(yīng)激；而谷胱甘肽GSH主要存在于細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體中，用于清除細(xì)胞中的過氧化物和有機(jī)過氧化物，在保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基脂質(zhì)過氧化方面起著重要作用[9]。當(dāng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)發(fā)生障礙時(shí)，SOD活力和GSH含量下降，導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激期SOD活力和GSH含量均顯著降低，說明熱應(yīng)激狀態(tài)下，雞群抗氧化能力下降，自由基產(chǎn)生過多，而清除減少，進(jìn)而對機(jī)體組織、細(xì)胞造成了氧化攻擊，這與此前相關(guān)熱應(yīng)激研究結(jié)果一致[10-11]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在高溫環(huán)境下，位于雞舍中端上層籠雞群的血漿SOD活力和GSH含量顯著低于下層籠位雞群，尤其是雞舍末端最頂端籠層雞群的SOD活力顯著低于其他籠層，說明夏季熱應(yīng)激對高密度層疊式籠養(yǎng)模式下雞群的損傷較為嚴(yán)重，尤其是末端上層籠雞群的應(yīng)激較大，這與前期觀察到的夏季死亡雞群主要位于雞舍末端上層籠位的現(xiàn)象相一致[3]。

3.2 熱應(yīng)激對蛋雞血漿血脂水平的影響

甘油三酯和總膽固醇是反映機(jī)體脂肪代謝的重要指標(biāo)，血漿中的甘油三酯在正常情況下保持著動(dòng)態(tài)平衡，其主要功能是供給與儲(chǔ)存能源。甘油三酯的來源主要有2種，即外源性和內(nèi)源性，外源性主要從食物中攝取，內(nèi)源性主要由肝臟和脂肪合成。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血漿甘油三酯的增高是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因子，而甘油三酯降低往往與甲狀腺功能亢進(jìn)、腎上腺皮質(zhì)功能降低以及肝臟功能損傷等相關(guān)[12-13]。在集約化蛋雞養(yǎng)殖過程中，由于籠養(yǎng)，產(chǎn)蛋雞較易形成脂肪肝，導(dǎo)致血漿中甘油三酯和總膽固醇含量顯著增高，而在本研究中，熱應(yīng)激狀態(tài)下，蛋雞血漿甘油三酯和總膽固醇含量呈現(xiàn)下降趨勢，其中熱應(yīng)激對血漿總膽固醇含量的影響較為顯著，這可能是由于高溫高濕環(huán)境導(dǎo)致雞群采食量下降，為維持機(jī)體生理需求，就需要?jiǎng)訂T機(jī)體自身儲(chǔ)存的能源，進(jìn)而導(dǎo)致雞群血漿血脂水平下降。從另一方面也說明，熱應(yīng)激狀態(tài)下的雞群可能存在著肝臟功能和內(nèi)分泌功能的紊亂[14-15]。

3.3 熱應(yīng)激對蛋雞血漿TNF-α、皮質(zhì)醇、內(nèi)毒素水平和熱應(yīng)激蛋白含量的影響

鑒于上述結(jié)果，進(jìn)一步檢測了熱應(yīng)激狀態(tài)下雞舍末端雞群血漿中TNF-α、皮質(zhì)醇、內(nèi)毒素和HSP70含量的變化，以探討熱應(yīng)激對高密度籠養(yǎng)蛋雞免疫細(xì)胞因子、腸道屏障功能以及內(nèi)分泌的影響。其中，TNF-α是一種由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種生物活性的炎性細(xì)胞因子，它可與其受體結(jié)合參與激活免疫反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥發(fā)生，誘發(fā)腫瘤的發(fā)生等[16]。在臨床研究中，TNF-α既可以作為一些疾病病情活動(dòng)的臨床指標(biāo)之一，也是疾病指標(biāo)的一個(gè)有效靶點(diǎn)[17]。皮質(zhì)醇是從腎上腺皮質(zhì)中提取出的、對糖類代謝具有最強(qiáng)作用的腎上腺皮質(zhì)激素，是機(jī)體HPA軸(下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng))的終端產(chǎn)物，也是重要的“應(yīng)激激素”[18]，它能夠有效反映機(jī)體受到的壓力時(shí)間和強(qiáng)度。前人研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激狀態(tài)下，蛋雞血漿的皮質(zhì)醇、TNF-α、內(nèi)毒素和HSP70含量顯著增加[19-20]，本研究表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下，不同籠層高密度籠養(yǎng)蛋雞的血漿皮質(zhì)醇、TNF-α、內(nèi)毒素和HSP70含量均呈現(xiàn)不同程度的上升。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，雞舍末端頂層籠雞群的血漿皮質(zhì)醇、TNF-α、內(nèi)毒素和HSP70含量顯著高于其他籠層，說明雞舍末端頂層籠雞群受到的熱應(yīng)激最為嚴(yán)重，也反映了高密度籠養(yǎng)雞舍雖采用了全自動(dòng)化的環(huán)境控制通風(fēng)降溫系統(tǒng)，但其對雞舍末端雞群的降溫效果并不是十分理想。

綜上所述，夏季高溫高濕環(huán)境誘發(fā)了高密度層疊式籠養(yǎng)蛋雞的熱應(yīng)激反應(yīng)，全自動(dòng)環(huán)境控制系統(tǒng)對此類養(yǎng)殖模式下雞舍夏季降溫效果不均勻，雞舍末端雞群的熱應(yīng)激現(xiàn)象較為嚴(yán)重。針對此養(yǎng)殖模式下的雞舍，建議適當(dāng)增加雞籠高度以利于風(fēng)流通過雞籠。