鄧張雙 施亞群 劉秀繼 杜維力 郭志勇 李 嘯 余賢軍 陳 暉

(1.三峽大學 生物與制藥學院天然產物研究與利用湖北省重點實驗室， 湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司研發(fā)中心， 湖北 宜昌 443003；3.湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院， 湖北 十堰 442000)

微生物合成的含氯化合物具有重要的生理功能[1]，是新藥候選藥物的重要來源之一，如分離于放線菌Salinispora tropica的含氯次級代謝產物Salinosporamide A是一種潛在的蛋白酶抑制劑[2]，對很多腫瘤細胞具有非常強的抑制活性.作為“寡營養(yǎng)、高鹽”的海洋生態(tài)系統(tǒng)，脅迫微生物產生耐鹽或嗜鹽的生理特性，因此，海洋來源的微生物是生產含氯化合物的主要源泉[3].

陸生微生物生產含氯化合物的研究鮮有報道[4].課題組從南京紫金山林區(qū)中的腐木上分離鑒定一株多孔菌半伏小薄孔Antrodiella semisupina[5]，該菌經土豆液體發(fā)酵，乙酸乙酯富集代謝產物，浸膏采用柱層析分離，得到5個次級代謝產物1-5，其中包括3個含氯化合物1-3，1，2和4均為首次從陸生真菌中分離.本文詳細報道了化合物1-5的分離、鑒定及抗腫瘤活性評價.

圖1 半伏小薄孔菌A.semisupina發(fā)酵液中次級代謝產物1-5化學結構式及高效液相色譜圖

分析條件：高效液相色譜儀為Dionex Ultimate 3000；色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100 ?，4.6×250 mm；流動相為甲醇-0.1%冰醋酸水溶液，30 min 10～100%梯度洗脫；流速為1 m L/min；檢測波長為254 nm；進樣量為5μL.

1 儀器與材料

核磁共振譜在Bruker-ARX-400核磁共振譜儀上測定，內標為TMS；化合物HRMS在Thermofisher EI質譜儀上測定；化合物純化和純度分析分別在Waters 1525EF和Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀上進行，分析型色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100?，4.6×250 mm，制備型色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100?，10×250 mm.

柱層析硅膠(200～300目)、薄層層析硅膠板(200 mm×200 mm)均購自青島海洋化工廠；凝膠填料為Sephadex LH-20.

半伏小薄孔菌(A.semisupina)保存于三峽大學生物與制藥學院天然產物研究與利用湖北省重點實驗室.

2 提取與分離

真菌Antrodiella semisupina采用PDB土豆液體培養(yǎng)基(5 L)室溫震蕩培養(yǎng)30 d，紗布過濾得到發(fā)酵培養(yǎng)菌液，減壓濃縮后的菌液依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯分別室溫萃取3次，濃縮后分別得到浸膏12 mg、300.6 mg.乙酸乙酯部位經Sephadex LH-20柱層析分離，合并相同組分，最終得到4個片段.片段3(156mg)經硅膠柱分離，氯仿/甲醇(v/v100∶1，100∶2和0∶100)洗脫，TLC及HPLC-DAD分析，合并相同組分，最終得到3個片段.片段2(78 mg)經制備型HPLC分離純化，分別得到化合物1(2.7 mg)，2(3.3 mg)，3(6.8 mg)，4(6.1 mg)和5(3.1 mg).

3 活性鑒定

采用RPMI-1640或DMEM(Gibco，Invitrogen，USA)培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231細胞，加入10%胎牛血清(FBS，HyClone，USA)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2.用不同濃度的GEA處理細胞48 h，用Automated Microplated Reader(Bio-Tek，VT，USA)在570 nm測量吸光度，抑制率計算為：抑制率(%)=(對照組的平均A570-實驗組的平均A570)/(對照組的平均A570-空白組的平均A570)×100%.

4 結構鑒定

化合物1為白色不定型粉末.EI-MS m/z 216.14[M]+和218.15[M+2]+顯示的分子離子峰暗示化合物1含有氯原子.結合NMR數(shù)據，推測化合物分子式為C10H13ClO3.氫譜顯示化合物含有一個雙峰甲基[δH 1.08(3H，d，J=6.4 Hz，H-3)]，兩個次甲基[δH 4.61(1H，d，J=4.0 Hz，H-1)和3.97(1H，dq，J=4.0，6.4 Hz，H-2)]質子信號.結合碳譜，可以發(fā)現(xiàn)兩個次甲基分別連有羥基[δC 76.6(C-1)和71.2(C-2)]，比較兩個次甲基質子耦合常數(shù)(J1-2=4.0 Hz)，推測兩個羥基以erythro構型存在.此外，氫譜低場部分顯示存在一個1，3，4三取代的苯環(huán)結構單元，剩余取代基團分別歸為氯原子、甲氧基.經與文獻比對[6，7]，化合物1被鑒定為erythro-1-(3'-Chloro-4'-methoxyphenyl)-1，2-propanediol(Trametol).

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.22(1H，dd，J=2.0，8.4 Hz，H-6')，6.92(1 H，d，J=8.4 Hz，H-5')，4.61(1H，d，J=4.0 Hz，H-1)，3.97(1H，dq，J=4.0，6.4 Hz，H-2)，3.91(3H，s，-OCH3)，1.08(3 H，d，J=6.4 Hz，H-3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：154.6(C-4')，133.5(C-1')，128.6(C-2')，126.1(C-6')，122.4(C-3')，111.8(C-5')，76.6(C-1)，71.2(C-2)，56.2(-OCH3)，17.4(C-3).EI-MS m/z 216.14[M]+，218.15[M+2]+.

化合物2為白色不定型粉末.EI-MS m/z 186.13[M]+和188.12[M+2]+顯示的分子離子峰暗示化合物2含有氯原子.結合NMR數(shù)據，推測化合物分子式為C8H7ClO3.氫譜、碳譜顯示化合物為一個1，3，4三取代苯環(huán)結構，其中取代基分別歸屬為甲氧基(δH 3.96)、氯原子、羧基(δC 166.3).經與文獻比對[8]，化合物2被鑒定為3-Chloro-4-methoxybenzoic Acid.

化合物3為白色不定性粉末.EI-MS m/z 220.09[M]+和222.09[M+2]+顯示的分子離子峰暗示化合物2含有氯原子.結合NMR數(shù)據，推測化合物分子式為C8H6Cl2O3.氫譜和碳譜暗示化合物為1，3，4，5四取代苯環(huán)結構，取代基分別歸屬為一個甲氧基(δH 3.86)、二個氯原子、一個羧基(δC 165.4).經與文獻比對[9，10]，化合物3被鑒定為3，5-Dichloro-4-methoxybenzoic Acid.

化合物4為白色不定型粉末.根據EI-MS和NMR數(shù)據，推測化合物分子式為C9H10O4.氫譜顯示化合物為1，3，4三取代的苯環(huán)結構，取代基包括兩個甲氧基(δH 3.85和3.83)、一個羧基(δC 168.3).經與文獻比對[11]，化合物4被鑒定為3，4-Dimethoxybenzoic acid(Veratric acid).

化合物5為黃色油狀液體.根據EI-MS和NMR數(shù)據，推測化合物分子式為C7H6O3.氫譜和碳譜顯示化合物為1，4二取代苯環(huán)結構，取代基分別為羥基和羧基(δC 168.1).經與文獻比對[12]，化合物5被鑒定為p-Hydroxybezoic Acid.

5 結果與討論

半伏小薄孔菌A.semisupina隸屬于擔子菌，常生長于闊葉樹上，引起木材白色腐朽，主要分布在中國、日本、新西蘭和美國.目前關于半伏小薄孔菌A.semisupina的研究僅僅限于分類學[13]，未見半伏小薄孔菌的次級代謝產物報道.少量文獻研究了小薄孔菌屬微生物的代謝物，主要為沒藥烷型倍半萜[14]、三并五環(huán)倍半萜、gymnomitrane型倍半萜[15]、蛇麻烷型倍半萜[16]和吲哚類生物堿[17].本文是首次報道半伏小薄孔菌A.semisupina的次級代謝產物1-5，所有化合物進行了MDA-MB-231細胞抑制活性評價，數(shù)據顯示沒有該乳腺癌細胞抑制活性.該菌合成陸生微生物少見生產的含氯化合物，在生物合成途徑和生物代謝酶方面具有重要的參考和研究價值.