胡江鋒

摘? 要：為篩選出理想的雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗的凍干工藝，保證疫苗產(chǎn)品質(zhì)量及免疫效果，更好地服務(wù)于畜牧業(yè)。本試驗(yàn)從凍干保護(hù)劑配方與凍干曲線入手，將含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的明膠5%蔗糖保護(hù)劑分別與表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組雞痘病毒（rFPV_ILTVgB）抗原按規(guī)定配比，分別在21、24.5、28 h的凍干曲線下完成凍干，并對(duì)凍干后的制品檢測(cè)其效價(jià)、真空度、剩余水分及物理性狀。結(jié)果表明，有1.0%明膠5%蔗糖保護(hù)劑24.5 h或28 h凍干曲線和1.2%明膠5%蔗糖保護(hù)劑28 h的凍干曲線三種凍干工藝，其制品效價(jià)、真空度、剩余水分、物理性狀均符合標(biāo)準(zhǔn)。因而采用1.0%明膠5%蔗糖的保護(hù)劑配方及24.5 h的凍干曲線是該制品較為理想的凍干工藝。

關(guān)鍵詞：雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗;保護(hù)劑配方;凍干曲線

近幾年，人民生活水平日益提高，對(duì)畜產(chǎn)品的需求不斷增大，而保障畜禽安全尤為重要，獸用疫苗在預(yù)防疫病方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，因凍干制品不但會(huì)延長(zhǎng)了制品的保存期，而且作為基礎(chǔ)免疫廣泛使用。冷凍干燥技術(shù)是指把欲凍溶液在低溫下凍結(jié)，然后在真空條件下升華干燥，除去冰晶，待大量水分升華結(jié)束后再進(jìn)行解析干燥，除去部分結(jié)合水的干燥方法。凍干時(shí)需添加一些輔助物，在干燥后起支撐與保護(hù)制品作用，該種物質(zhì)稱為凍干保護(hù)劑。在獸用生物制品保護(hù)劑中，常用的有牛奶、蔗糖和明膠。由于明膠蔗糖保護(hù)劑成本低、制備容易、保存方便及與抗原配比時(shí)用量小，可增加凍干苗的單位（瓶）產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)[1]。本試驗(yàn)選擇不同濃度的明膠5%蔗糖保護(hù)劑與表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒重組雞痘病毒（rFPV_ILTVgB）按規(guī)定配比混勻后，采用不同凍干曲線進(jìn)行制品凍干試驗(yàn)，旨在篩選出理想的雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗的凍干工藝（即設(shè)定凍干機(jī)板層的不同溫度及其經(jīng)過時(shí)間），以保障獸用疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量。

1? 材料與方法

1.1? 主要設(shè)備? GLZZQ-1型凍干機(jī)，北京速原真空技術(shù)有限公司;真空干燥箱（BZX-6090），上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2? 病毒液? 按《雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》中方法[2]生產(chǎn)其合格病毒液，來源于楊凌綠方生物工程有限公司凍干苗車間細(xì)胞班，批號(hào)20190403。

1.3? 明膠? 分析純，國藥集團(tuán)化藥試劑有限公司，批號(hào)F20180620。

1.4? 凍干樣品制備

1.4.1? 將已滅菌的含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%明膠5%蔗糖保護(hù)劑分別與表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒重組雞痘病毒液按規(guī)定的配比混勻后，分裝于10 mL西林瓶，2.5 mL/瓶，分別在21、24.5、28h的凍干曲線下凍干，凍干后抽樣檢驗(yàn)，凍干曲線見圖1、2、3。

如圖1所示，凍干機(jī)開機(jī)后，把其板層溫度降到7 ℃，分裝產(chǎn)品的西林瓶裝進(jìn)凍干機(jī)板層上，經(jīng)過1.5 h將板層溫度降到-40 ℃，維持1.5 h完成產(chǎn)品凍結(jié);在1.5 h內(nèi)將板層升溫至-5 ℃，維持9.5 h完成產(chǎn)品升華干燥;在2.5 h內(nèi)將板層升溫至28 ℃，維持4.5 h完成產(chǎn)品解析干燥后，結(jié)束產(chǎn)品凍干過程。

如圖2所示，凍干機(jī)開機(jī)后，把其板層溫度降到7 ℃，分裝產(chǎn)品的西林瓶裝進(jìn)凍干機(jī)板層上，經(jīng)過1.5 h將板層溫度降到-40 ℃，維持1.5 h完成產(chǎn)品凍結(jié);在1.5 h內(nèi)將板層升溫至-5 ℃，維持13 h完成產(chǎn)品升華干燥;在2h內(nèi)將板層升溫至28 ℃，維持5 h完成產(chǎn)品解析干燥后，結(jié)束產(chǎn)品凍干過程。

如圖3所示，28 h凍干曲線，凍干機(jī)開機(jī)后，把其板層溫度降到7 ℃，分裝產(chǎn)品的西林瓶裝進(jìn)凍干機(jī)板層上，經(jīng)過1.5 h將板層溫度降到-40 ℃，維持1.5 h完成產(chǎn)品凍結(jié);在1.5 h內(nèi)將板層升溫至-5 ℃，維持16.5 h完成產(chǎn)品升華干燥;在1.5 h內(nèi)將板層升溫至28 ℃，維持5.5 h完成產(chǎn)品解析干燥后，結(jié)束產(chǎn)品凍干過程。

1.4.2? 按1.4.1方法再重復(fù)凍干兩次。

1.5? 凍干制品檢測(cè)

1.5.1? 物理性狀、真空度及剩余水分檢測(cè)? 按《中華人民共和國獸藥典》中方法[3]及標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行。合格標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定：物理性狀，淡黃色疏松團(tuán)狀，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解成粉紅色液體;真空度，將高頻火花真空測(cè)定器指向容器內(nèi)無制品的部位，容器內(nèi)出現(xiàn)白色或粉色或紫色輝光;剩余水分，應(yīng)不超過4%[4]。

1.5.2? 效價(jià)測(cè)定? 按《雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》中方法[2]及標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行。合格標(biāo)準(zhǔn)：雞傳染性喉氣管炎要達(dá)對(duì)照雞≥7/10發(fā)病，免疫雞≥7/10保護(hù);雞痘每羽份病毒含量≥1.0×104 PFU。

2? 結(jié)果

凍干制品的檢測(cè)結(jié)果見表1、2、3。

從表1看出，此凍干曲線下，只有選用1.0%明膠5%蔗糖保護(hù)劑凍干的制品效價(jià)、真空度、物理性狀均合格，但是剩余水分含量高于國標(biāo)4.0%[4]，綜合判定全為不合格制品。

從表2看出，此凍干曲線下，只有選用1.0%明膠5%蔗糖保護(hù)劑凍干的制品的效價(jià)、真空度、剩余水分、物理性狀均合格。

從表3看出，此凍干曲線下，選用1.0%、1.2%明膠5%蔗糖保護(hù)劑凍干的制品效價(jià)、真空度、剩余水分、物理性狀均合格。

3? 結(jié)論

從凍干制品測(cè)定結(jié)果可以看出，選用1.0%明膠5%蔗糖保護(hù)劑24.5 h或28 h凍干曲線及選用1.2%明膠5%蔗糖保護(hù)劑28 h的凍干曲線的凍干制品，檢測(cè)其效價(jià)、真空度、剩余水分、物理性狀均能達(dá)到制品質(zhì)量指標(biāo)[5];又從經(jīng)濟(jì)效益及生產(chǎn)組織方面考量，24.5 h凍干時(shí)間縮短，減輕了設(shè)備損耗，降低動(dòng)力運(yùn)行費(fèi)用，生產(chǎn)組織比較便利，而且1.0%的明膠減少了材料消耗成本，因此綜合判定1.0%明膠5%蔗糖保護(hù)劑24.5 h凍干曲線為該產(chǎn)品較理想的凍干工藝。

本試驗(yàn)為各企業(yè)確定生產(chǎn)環(huán)節(jié)的凍干工藝，提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的參考，建議結(jié)合企業(yè)自身實(shí)際，靈活運(yùn)用。但有關(guān)凍干過程中的升華溫度和時(shí)間對(duì)制品質(zhì)量的影響，有待進(jìn)一步探索，以不斷提升該產(chǎn)品凍干工藝水平，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 傅德霞，衣寧，賈華強(qiáng)，等.兩種凍干保護(hù)劑在禽病疫苗生產(chǎn)中的效果比較[J].中國獸藥雜志， 1997，（03），10-12.

[2]? 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程[S].北京：中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2005.

[3]? 中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典（2015年版）[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016.

[4]? 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì).中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程（2000年版）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

[5]? 中國獸藥典委員會(huì).獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：生物制品卷（2017年版）[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2017.

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