付 龍 鄧 浩 代 婧 鄧宇淋 羅加明 李 君 褚貴新 陶 瑞

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

0 引言

本試驗(yàn)在25 ℃的培養(yǎng)條件下，以堿性石灰性土壤為研究對(duì)象，研究有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施硝化抑制劑氯甲基吡啶對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化和氨氧化微生物群落數(shù)量、功能和結(jié)構(gòu)的影響，以期闡明土壤硝化過(guò)程微生物對(duì)有機(jī)施肥和抑制劑添加的響應(yīng)機(jī)制，為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮素優(yōu)化管理提供理論依據(jù).

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用堿性土壤，取自新疆石河子(86°06′E，44°32′N(xiāo))，采取耕層0～0.2 m土壤帶回實(shí)驗(yàn)室去除礫石和根系等雜質(zhì)，自然風(fēng)干后過(guò)2 mm篩后保存待用.土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)包括有機(jī)質(zhì)含量13.5 g·kg-1；全氮0.95 g·kg-1；全磷0.30 g·kg-1；堿解氮88.6 mg·kg-1；速效磷23.4 mg·kg-1；速效鉀136.0 mg·kg-1；pH值8.1.尿素含氮量46.0%，腐熟牛糞，有機(jī)質(zhì)含量：38.8%，含N：1.5%，含P2O5：2.01%，含K2O：0.21%；CP(純度為99.7%)由浙江奧復(fù)托有限公司提供，用量為純N量的2.5‰.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤微域模擬試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)，培養(yǎng)溫度25 ℃，分別為：(1)CK(不施肥)；(2)CF(100%尿素N處理)；(3)COM(60%尿素N+40%牛糞N)；(4)COM+CP(60%尿素N+40%牛糞N+硝化抑制劑CP).除CK外，所有施肥處理的純N用量為0.35 g·kg-1干土，保持各處理N含量一致.

1.3 培養(yǎng)方法

1.4 土壤分析

1.4.1 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.4.2 氨氧化微生物基因拷貝數(shù)測(cè)定

土壤總NDA的提取：土壤樣品DNA提取使用Powersoil ? DNA Isolation Kit(MoBio,San Diego,美國(guó))，每個(gè)土壤樣品稱(chēng)0.35 g，土壤DNA提取參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.提取好的DNA采用Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Nano Drop Technologies Inc，USA)檢測(cè)濃度.將提取好的DNA稀釋10倍后保存在-20 ℃下備用.

利用qPCR技術(shù)測(cè)定硝化微生物的基因拷貝數(shù).用來(lái)擴(kuò)增硝化功能基因的PCR引物如表1所示.其中AOA和AOB的引物分別為amoAF，amoAR(Francis等，2005)和amoA1F和amoA2R(Rotthauwe等，1997)，反應(yīng)條件為95 ℃ for 2 min×1 cycle；95 ℃ for 20 s，55 ℃ for 20 s，72 ℃ for 30 s，80 ℃ for 15 min×40 cycles；擴(kuò)增效率分別為92%和96%.結(jié)果以每克干土重的基因拷貝數(shù)(copies·g-1)表示.

1.4.3 高通量測(cè)序技術(shù)的測(cè)定

利用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)AOA和AOB進(jìn)行高通量測(cè)序，引物選取同qPCR一致，采用滑動(dòng)窗口法對(duì)雙端的FASTQ序列做質(zhì)量過(guò)濾，利用軟件FLASH(version1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對(duì)通過(guò)質(zhì)量過(guò)濾的序列進(jìn)行連接，對(duì)連接上的序列進(jìn)行過(guò)濾和去除嵌合體，得到優(yōu)質(zhì)序列.基于OTU聚類(lèi)和注釋的分析結(jié)果，進(jìn)行AOA和AOB多樣性分析.

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel2019和SPSS23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和計(jì)算，用GraphPad Prism version7.04進(jìn)行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)無(wú)機(jī)肥與硝化抑制劑聯(lián)用對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化的影響

圖1 土壤和含量變化

2.2 不同施肥處理下土壤pH和EC動(dòng)態(tài)變化

由圖2(a)可知，土壤pH變化在培養(yǎng)周期內(nèi)各個(gè)處理的動(dòng)態(tài)變化都是先上升后下降，在CF處理的第7 d達(dá)到峰值.但后期下降快于COM+CP和CK處理.由圖2(b)可知，土壤EC變化與pH變化相反，EC變化是先上升然后趨于穩(wěn)定，COM+CP的處理的電導(dǎo)率總體要低于COM和CF處理，說(shuō)明有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施添加硝化抑制劑CP會(huì)減輕土壤酸化和發(fā)生次生鹽漬化的風(fēng)險(xiǎn).

圖2 不同處理土壤pH和電導(dǎo)率的動(dòng)態(tài)變化

COM和COM+CP處理的SOC、全氮、速效鉀、速效磷和CEC含量相比CK和CF處理有明顯地提高(P<0.05).COM處理相比CF處理顯著地增加了MBC和MBN含量，而硝化勢(shì)有降低但差異不明顯.COM+CP處理相比COM處理則顯著地降低了土壤的微生物量，其中MBC降低了71.4%,由此說(shuō)明，施肥顯著增加了土壤生物和化學(xué)質(zhì)，而配施硝化抑制劑CP會(huì)降低土壤的微生物量碳和微生物量氮.

表1 土壤各處理生物化學(xué)性質(zhì)的變化

處理SOC全氮全磷速效鉀速效磷CECMBCMBN g·kg-1g·kg-1g·kg-1mg·kg-1mg·kg-1cmol(+)kg-1mg·kg-1mg·kg-1CK15.7±0.461.4±0.060.4±0.0455.7±1.15106.1±0.6014.8±0.67121.4±29.1630.8±6.91CF15.9±0.521.6±0.060.4±0.0754.4±0.36107.3±0.6023.6±4.40150.5±38.8039.1±4.57COM18.7±0.461.8±0.040.5±0.0471.9±2.58130.9±1.2029.6±1.42221.8±59.2774.4±8.91CP18.0±0.161.9±0.070.4±0.0673.5±0.96134.3±0.5231.1±2.5263.4±25.8723.8±1.73

2.4 氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

由圖3可知，不同的施肥處理對(duì)AOA的結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的影響，而對(duì)AOB群落產(chǎn)生了明顯變異.在第一排序軸上，COM或CF與CK及COM+CP明顯分離.此外，在第2分類(lèi)軸上，COM+CP與CK顯著分開(kāi).這些結(jié)果表明，AOB群落相比于AOA群落對(duì)有機(jī)肥和硝化抑制劑CP添加更敏感.

圖3 不同施肥處理下AOA與AOB菌群多樣性變化

2.5 氨氧化微生物基因數(shù)量的變化

由圖4(a)可以看出，在不同施肥處理中，AOAamoA基因拷貝數(shù)無(wú)顯著差異，AOBamoA基因拷貝數(shù)范圍從1.1×106-4.2×106g-1干土，不同施肥制度之間的AOB數(shù)量有顯著差異.與CK相比，CF和COM處理顯著地提高了AOB的菌群數(shù)量.COM處理相比CF處理有提高但差異不顯著，COM+CP處理相比COM處理顯著降低了AOBaomA基因拷貝數(shù).由圖4(b)可以看出，土壤的硝化勢(shì)與土壤AOA的基因拷貝數(shù)沒(méi)有顯著的相關(guān)性(R2=0.295 4，P=0.168 6)，而與土壤AOB的基因拷貝數(shù)呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性(R2=0.320 9，P=0.017 9).說(shuō)明在此有機(jī)增碳添加抑制劑的條件下，土壤硝化作用與AOB更緊密相關(guān).

圖4 不同施肥處理下AOA與AOB基因數(shù)量的變化及土壤硝化勢(shì)的關(guān)系

2.6 不同土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)氨氧化微生物數(shù)量的相對(duì)貢獻(xiàn)

圖5 不同土壤理化性質(zhì)對(duì)氨氧化微生物的相對(duì)貢獻(xiàn)值

3 討論

3.1 有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施硝化抑制劑對(duì)AOA和AOB的影響

在本研究中，AOB基因數(shù)量與土壤潛在硝化勢(shì)存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)，而與AOA無(wú)顯著關(guān)系(P>0.05)，說(shuō)明AOB可能主導(dǎo)施肥下石灰性土壤的硝化過(guò)程，同時(shí)，有機(jī)肥聯(lián)合CP施用顯著降低了AOB的基因數(shù)量，且改變了其群落結(jié)構(gòu)，而對(duì)AOA沒(méi)有明顯抑制作用.本研究結(jié)果與趙偉燁等[7]的研究類(lèi)似.賀紀(jì)正等[8]的研究也表明堿性土壤中不同施肥處理對(duì)AOB的數(shù)量及組成有明顯影響而對(duì)AOA的影響較小.吳玲等[9]在對(duì)太湖生態(tài)環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)太湖表層沉積物中總氮含量顯著影響AOB群落豐度.在本研究中，不同施肥處理未使AOA種群豐富度變化的主要原因可能是AOA喜歡低pH和養(yǎng)分貧瘠的土壤環(huán)境，Auguet等[10]的研究也證明AOA的耐酸和耐土壤養(yǎng)分貧瘠生態(tài)位.本研究結(jié)果顯示有機(jī)無(wú)機(jī)配施會(huì)一定程度上增加AOB基因數(shù)量，這表明石灰性土壤在有機(jī)肥添加后會(huì)促進(jìn)AOB的增長(zhǎng)，這與He等[16]的研究結(jié)果一致，他發(fā)現(xiàn)在有機(jī)質(zhì)肥沃的土壤中AOB/AOA的比例比未施肥的土壤高.相似地，Taylor等[17]觀察到AOB相比AOA對(duì)肥料處理更加敏感.Di等[18]研究表明，AOA較AOB有著更好的抗逆性，在氮含量較高的草地生態(tài)系統(tǒng)中，AOB是硝化過(guò)程的主導(dǎo)者.雖然在本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件下，不同施肥條件下的AOA基因拷貝數(shù)基因數(shù)量并沒(méi)有顯著變化，但AOA在硝化過(guò)程中仍可能扮演著重要的作用，Ouyang等[19]研究證實(shí)雖然AOB對(duì)環(huán)境擾動(dòng)響應(yīng)更敏感，但AOA同樣對(duì)硝化起重要的作用.一般在酸性土地中，缺乏氮肥的情況下，硝化過(guò)程主要由AOA來(lái)驅(qū)動(dòng)[20].綜上所述，在土壤肥沃、堿性的土地中，AOB在硝化過(guò)程中扮演著更加重要的角色，并且對(duì)有機(jī)肥和硝化抑制劑氯甲基吡啶施用更敏感.

3.2 土壤化學(xué)因子驅(qū)動(dòng)土壤氨氧化微生物基因數(shù)量變化

4 結(jié)論