謝美娜 李 晶 楊利霞 王云澤 樊立濤 楊國峰 徐蘭舉

(河北愛能生物科技股份有限公司，石家莊 050092)

皮膚是人體最大最重要的屏障性器官，主要起到保護(hù)和維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的作用[1]。深I(lǐng)I度以下中小面積燒燙傷是最常見的皮膚創(chuàng)傷性疾病，早期削痂，及時(shí)封閉創(chuàng)面是減輕患者疼痛提高治療效果最關(guān)鍵、最有效的措施之一[2-4]。燒傷創(chuàng)面敷料封閉創(chuàng)面可抑制或減少創(chuàng)面微生物滋生引起的感染，維持創(chuàng)面濕潤環(huán)境，保護(hù)和促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長。但傳統(tǒng)敷料因無法保持創(chuàng)面濕潤，容易感染，且與肉芽組織粘連會(huì)造成創(chuàng)面二次傷害等原因，在臨床應(yīng)中逐漸被天然敷料、藥用敷料、組織工程類敷料等新型敷料取代[5-7]。

脫細(xì)胞生物敷料是近年來發(fā)展最為迅速的天然敷料之一，它源于動(dòng)物真皮組織，在制備過程中已經(jīng)除去了細(xì)胞成分等免疫原性物質(zhì)，生物安全性好[8]；保留天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，膜片厚度適中，柔軟度和粘附性好，在燒燙傷治療中，可有效貼附于創(chuàng)面，即可以起到皮膚的部分屏障功能，透氣保濕，又形成相對(duì)密封的內(nèi)環(huán)境，減少創(chuàng)面與外環(huán)境的接觸，降低或減少創(chuàng)面二次感染風(fēng)險(xiǎn)、從而最大限度地保護(hù)間生態(tài)組織及殘存的皮膚組織[6,9]；脫細(xì)胞生物膜主要成分為膠原蛋白，在體液中酶的作用下，可能會(huì)分解出氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，這可能在一定程度上促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞遷移、粘附、分化和增殖等，從而明顯加速創(chuàng)面愈合[4,10]。本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)比觀察脫細(xì)胞生物敷料和傳統(tǒng)敷料在治療深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面的愈合情況和病理進(jìn)程，說明脫細(xì)胞生物敷料對(duì)促進(jìn)皮膚損傷創(chuàng)面愈合作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼養(yǎng)環(huán)境

巴馬實(shí)驗(yàn)用小型豬，普通級(jí)24只，雌雄不限，6月齡，體質(zhì)量(15±3)kg，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫，濕度40%～70%，正常晝夜[11-12]。飼養(yǎng)方式為單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)籠具為鍍鋅鋼管籠。動(dòng)物自由飲水，每頭每天分兩次供給其體質(zhì)量5%的飼料。所有試驗(yàn)動(dòng)物由北京通和生泰比較醫(yī)學(xué)研究所提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2015-0004。動(dòng)物合格證號(hào)：NO.111017000000001

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

Mettler-Toledo TCS-250型電子臺(tái)秤(梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司，上海)；KD-2268型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備公司，浙江)；KD-TS3D型生物組織脫水機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備公司，浙江)；KD-BMI石蠟包埋機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備公司，浙江)；KD-THIII型攤烤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備公司，浙江)；CX21型Olympus顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司，北京);UV-5200PC型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司，上海)。

1.3 主要試劑耗材

規(guī)格5 cm×7 cm脫細(xì)胞生物敷料(河北愛能生物科技股份有限公司，河北)；脫脂棉紗布(曹縣華魯衛(wèi)生材料有限公司，山東)；戊巴比妥鈉(sigma，美國)；陸眠寧Ⅱ(吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司，吉林)；蘇木素(北京索萊寶科技有限公司，北京)；伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司，北京)；氯胺T(天津博迪化工股份有限公司，天津)；L-羥脯氨酸對(duì)照品(中國藥品生物制品鑒定所，北京)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1模型制備：24只巴馬實(shí)驗(yàn)用小型豬，實(shí)驗(yàn)前24 h禁食不禁水，3%戊巴比妥鈉(0.5 mL/kg體質(zhì)量)劑量靜脈注射，進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，3 min后靜脈注射陸眠寧Ⅱ(0.1 mL/kg)進(jìn)行麻醉。麻醉后仰臥保定，機(jī)械去毛法去除背部豬毛，清潔后酒精消毒備皮。利用銅錠制備燙傷模型[13-15]，將4 cm×6 cm的銅錠在100 ℃的水浴鍋中預(yù)熱，待水浴鍋沸騰時(shí)，迅速將銅塊置于動(dòng)物一側(cè)背部停留10 s，在小型豬背部中線兩側(cè)制作兩個(gè)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面。

1.4.2實(shí)驗(yàn)分組: 隨機(jī)分為兩組，每組12只。創(chuàng)面制備24 h后，削痂除去壞死表皮，試驗(yàn)組使用脫細(xì)胞生物敷料覆蓋創(chuàng)面，空白對(duì)照組使用脫脂棉紗布覆蓋創(chuàng)面，分別再用無菌紗布固定包扎。分別于術(shù)后1、2、3、4周對(duì)各組進(jìn)行觀察，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材3只。

1.4.3觀察指標(biāo)

1.4.3.1 臨床觀察：對(duì)試驗(yàn)組和空白對(duì)照組進(jìn)行創(chuàng)面修復(fù)情況的臨床觀察。包括創(chuàng)面色澤、滲出液、壞死組織、創(chuàng)面的結(jié)痂、被毛生長情況。

1.4.3.2 創(chuàng)面愈合率的測(cè)定： 參照Nagelschmidt法[16-17]計(jì)算創(chuàng)面愈合率：使用透明的稱量紙覆蓋在動(dòng)物的背部創(chuàng)面，將創(chuàng)面邊緣和愈合創(chuàng)面邊緣描繪在透明的稱量紙上，剪去多余紙片，稱得原始創(chuàng)面紙片質(zhì)量，剪下未愈合創(chuàng)面紙片，稱得未愈合紙片質(zhì)量，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率(%)=(原始創(chuàng)面紙片質(zhì)量-未愈合創(chuàng)面紙片質(zhì)量)/原始創(chuàng)面紙片質(zhì)量×100%。

1.4.3.3 組織病理學(xué)觀察：于術(shù)后1、2、3周和4周對(duì)試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的燙傷面進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。對(duì)所取得的創(chuàng)面組織用4%甲醛溶液固定，制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察創(chuàng)面的修復(fù)情況，包括皮膚的修復(fù)、組織細(xì)胞的變化，并對(duì)創(chuàng)面的炎癥細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)[18]。

表1 炎性細(xì)胞半定量組織學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for semi-quantitative histological evaluation of inflammatory cells

1.4.3.4 創(chuàng)面羥脯氨酸含量測(cè)定: 采用氯胺T法繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并于術(shù)后1、2、3周和4周對(duì)試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的燙傷面進(jìn)行羥脯氨酸含量測(cè)定[19-20]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

整個(gè)手術(shù)觀察期間所有動(dòng)物全部存活，且均無創(chuàng)面感染情況發(fā)生。試驗(yàn)組術(shù)后創(chuàng)面干燥，2周后開始結(jié)痂，3周后開始脫痂，并且開始有被毛長出，4周后結(jié)痂與新生皮膚分離，被毛長出約2 mm；空白對(duì)照組術(shù)后1周創(chuàng)面表面局部有感染樣滲出，其余部位干燥，2周后創(chuàng)面開始結(jié)痂，4周后結(jié)痂與新生皮膚開始分離，逐漸有被毛長出。

2.2 創(chuàng)面愈合率

經(jīng)觀察計(jì)算術(shù)后1周試驗(yàn)組的創(chuàng)面愈合率為(23.67±1.03)%，而空白對(duì)照組為(22.50±1.04)%，兩組的創(chuàng)面愈合情況沒有顯著性差異(P>0.05)；術(shù)后2周、3周試驗(yàn)組的創(chuàng)面愈合狀況明顯加快，且數(shù)值比較試驗(yàn)組的創(chuàng)面愈合率顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)。術(shù)后4周 試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的創(chuàng)面恢復(fù)情況基本完成，兩組的創(chuàng)面愈合率數(shù)值比較無顯著性差異(P>0.05)。

表2 試驗(yàn)組與空白對(duì)照組的創(chuàng)面愈合率比較Table 2 Comparison of wound healing rate between experimental group and blank control

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)組的平均創(chuàng)面愈合時(shí)間為(20.83±0.75)d，空白對(duì)照組的平均愈合時(shí)間為(27.33±1.03)d，兩者比較具有顯著差異性(P<0.01)。試驗(yàn)組的平均愈合時(shí)間比空白對(duì)照組約提前6 d。

2.3 組織病理學(xué)觀察

術(shù)后1周，試驗(yàn)組燙傷部位局部表皮剝脫，其下真皮層凝固壞死，膠原纖維變性、腫脹、排列疏松，血管擴(kuò)張淤血，大量炎癥細(xì)胞浸潤；空白對(duì)照組與試驗(yàn)組病理組織學(xué)變化基本相同(圖1-1A，1B)。

術(shù)后2周，試驗(yàn)組燙傷部位毛囊、汗腺上皮和成纖維細(xì)胞增生活躍，細(xì)胞肥大，汗腺管變實(shí)，發(fā)生痂下愈合，生成肉芽組織并向膠原纖維壞死處爬行，炎癥反應(yīng)降低；而空白對(duì)照組毛囊和汗腺上皮已有增生，細(xì)胞、汗腺管變化與試驗(yàn)組相同，且也已有痂下愈合(圖1-2A，2B)。

術(shù)后3周，試驗(yàn)組燙傷部位肉芽組織可見新生毛細(xì)血管生成，殘存皮膚附件上皮細(xì)胞長出新生上皮，開始為上皮島，而后擴(kuò)大，融合而使?fàn)C傷面愈合；空白對(duì)照組出現(xiàn)上皮再生，上皮島已產(chǎn)生(圖1-3A，3B)。

術(shù)后4周，試驗(yàn)組燙傷部位的皮膚各層結(jié)構(gòu)清晰，表皮透明層、顆粒細(xì)胞層、棘細(xì)胞層、基底層生長良好且表皮連續(xù)覆蓋于膠原纖維生成致密乳頭層上；空白對(duì)照組表皮細(xì)胞層已生長，但結(jié)構(gòu)界線不夠清晰(圖1-4A，4B)。

同時(shí)本研究對(duì)各組燙傷創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)切片按照表1中炎性細(xì)胞半定量組織學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[18]對(duì)其燙傷創(chuàng)面部位的炎癥細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果詳見表3。術(shù)后1、2和3周炎癥細(xì)胞浸潤情況試驗(yàn)組的明顯輕于空白對(duì)照組，兩者比較具有顯著差異性(P<0.01)。術(shù)后4周炎癥細(xì)胞浸潤情況兩組無明顯差異(P>0.05)。

表3 燙傷創(chuàng)面的炎癥細(xì)胞浸潤情況統(tǒng)計(jì)(n=6)Table 3 Statistics of inflammatory cell infiltration in scalded wounds(n=6)

2.4 創(chuàng)面羥脯氨酸含量變化

創(chuàng)面愈合的一個(gè)主要表現(xiàn)是膠原蛋白的沉積和修復(fù)，膠原蛋白的主要成分是羥脯氨酸，其在膠原蛋白含量恒定，測(cè)定創(chuàng)面羥脯氨酸含量可以反映其膠原蛋白含量[21-22]。各組燙傷創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)的羥脯氨酸含量變化顯示，術(shù)后1周、2周實(shí)驗(yàn)組羥脯氨酸含量顯著高于空白對(duì)照組，說明術(shù)后前兩周實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面膠原蛋白合成顯著高于空白對(duì)照組；術(shù)后3周、4周實(shí)驗(yàn)組羥脯氨酸含量趨于穩(wěn)定，說明創(chuàng)面已經(jīng)完成修復(fù)；空白對(duì)照組術(shù)后4周羥脯氨酸含量與實(shí)驗(yàn)組無顯著差異，兩組創(chuàng)面均已完成修復(fù)。綜上所述脫細(xì)胞生物敷料可以加快膠原蛋白合成促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

表4 創(chuàng)面羥脯氨酸含量變化Table 4 Hydroxyproline contents of

3 討論

中小面積Ⅱ度燒燙傷是臨床常見皮膚外科損傷，傷口常累及真皮深層，滲出液多，易發(fā)生感染，患者疼痛面積大時(shí)間長。臨床上Ⅱ度燒燙傷多采用納米銀+磺胺嘧啶銀霜覆蓋治療，治療過程中需要反復(fù)換藥，增加患者痛苦，易造成二次創(chuàng)傷，治療費(fèi)用高、愈合時(shí)間長[23]。早期臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)移植自體真皮組織可以抑制肉芽組織生長和疤痕生成，但自體皮膚來源有限，不適用于大面積皮膚燒傷患者[24]。Heck等[25]發(fā)現(xiàn)異體真皮和自體表皮復(fù)合移植于燒傷患者的切痂創(chuàng)面，可以減少自體皮膚用量，且移植效果比單純的皮片移植效果好，但是異體皮具有一定免疫原性，可導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)。隨后，Wainwright[26]將異體皮膚經(jīng)過脫細(xì)胞處理，降低免疫原性并成功用于燒傷創(chuàng)面并取得較好的效果。但是異體皮供體來源有限而且有傳播人類疾病的可能性，所以有研究者開始探索異種脫細(xì)胞材料在燒燙傷治療中的應(yīng)用。齊順貞等[27]研究異種與異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與自體刃厚皮復(fù)合移植和自體中厚皮移植3種移植方式比較發(fā)現(xiàn)臨床上自體皮成活率、收縮率和瘢痕情況等效果相似，均可用于嚴(yán)重?zé)隣C傷患者皮膚重建。楊紅明等[28]研究發(fā)現(xiàn)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面早期利用選擇性去細(xì)胞豬皮包扎可有效保護(hù)創(chuàng)面并促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其效果明顯優(yōu)于常規(guī)換藥療法。

脫細(xì)胞生物敷料經(jīng)過漫長的發(fā)展過程，現(xiàn)在上市的脫細(xì)胞產(chǎn)品主要有異體皮脫細(xì)胞基質(zhì)、豬源脫細(xì)胞基質(zhì)、牛源脫細(xì)胞基質(zhì)等[29]。LifeCell公司的Alloderm以及北京清源偉業(yè)生物組織工程科技有限公司的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)軟組織補(bǔ)片均是由新鮮人尸體皮制備的脫細(xì)胞基質(zhì)，該類產(chǎn)品存在來源有限、保存條件苛刻、傳播人類疾病的可能性、價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，現(xiàn)在很少用于燒燙傷敷料多用于腹腔補(bǔ)片等[30-31]。牛源脫細(xì)胞基質(zhì)上市主要有PriMatrixTM和SurgiMend?，其原材料為胎牛皮，該類產(chǎn)品原材料市場容量小、價(jià)格昂貴、具有海綿狀腦病毒感染風(fēng)險(xiǎn)[29]。本實(shí)驗(yàn)中的敷料由河北愛能生物科技股份有限公司提供，是由豬真皮基質(zhì)經(jīng)過脫細(xì)胞和滅菌處理制備而成，主要成分是天然膠原蛋白，因不含細(xì)胞成分，所以生物相容性，免疫原性低[31-33]。該敷料原材料為豬皮，豬生長周期短、市場存欄量高，我公司按照相關(guān)法律法規(guī)從原材料源頭及生產(chǎn)每一個(gè)步驟進(jìn)行控制，保障產(chǎn)品無病毒/傳染性病原體和極低的免疫原性[34]。

脫細(xì)胞生物敷料柔軟而富有彈性，可與創(chuàng)面緊密貼服，減少創(chuàng)面滲出。敷料的天然三維結(jié)構(gòu)使其具有良好的透氣保濕功能，為創(chuàng)面修復(fù)提供適宜的微環(huán)境，在治療過程中，一般無需揭去創(chuàng)面基質(zhì)敷料，不會(huì)對(duì)新生肉芽組織造成二次創(chuàng)傷，理論上，脫細(xì)胞敷料治療燒燙傷創(chuàng)面的效率要比傳統(tǒng)治療方法效率高。實(shí)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明使用脫細(xì)胞生物敷料治療能夠有效地促進(jìn)創(chuàng)面上皮化，比傳統(tǒng)的紗布處理方式的愈合時(shí)間至少縮短6 d，且在愈合過程不會(huì)出現(xiàn)排斥、壞死、滲血、感染等現(xiàn)象，炎癥細(xì)胞浸潤明顯輕于傳統(tǒng)的紗布處理方式。與用大鼠制備燙傷模型并以護(hù)創(chuàng)膜覆蓋治療為創(chuàng)面提供濕潤環(huán)境加速創(chuàng)面愈合提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量的研究結(jié)果一致[35]。同時(shí)與臨床上馮祥生等使用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)治療深Ⅱ度燒傷的結(jié)果一致，均證明了脫細(xì)胞生物敷料有助于保護(hù)剩余的真皮組織，促進(jìn)上皮化，抑制疤痕的生成，加速創(chuàng)面愈合[36]。

脫細(xì)胞生物敷料治療燙傷創(chuàng)面主要分為3個(gè)階段，即炎癥階段、增生階段和重建階段[37-39]。術(shù)后創(chuàng)面處于炎癥階段，炎癥細(xì)胞主要包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。術(shù)后創(chuàng)面血小板聚集并促進(jìn)趨化因子、生長因子、促凝因子等細(xì)胞因子。細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞按照一定規(guī)律協(xié)作促進(jìn)創(chuàng)面愈合。術(shù)后1周時(shí)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面主要處于該階段，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，創(chuàng)面開始愈合。創(chuàng)面愈合第二階段是增生階段，主要是修復(fù)細(xì)胞增殖、分化和肉芽組織形成。肉芽組織內(nèi)積聚了大量的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、生長因子等，是上皮化的支架。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生足夠的膠原和細(xì)胞外基質(zhì)成分使傷口逐漸縮小創(chuàng)面，血管內(nèi)皮細(xì)胞和新生的毛細(xì)血管也不斷增殖遷移、融合并促進(jìn)表皮再生。術(shù)后2到3周實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面主要處于該階段，主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管快速增殖、肉芽組織形成、創(chuàng)面上皮化，創(chuàng)面羥脯氨酸含量增高也說明創(chuàng)面膠原含量增高形成細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面愈合第三階段為重建階段，主要是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積及重新分配與調(diào)整。皮膚中一些大分子，如膠原蛋白、纖維粘連蛋白、透明質(zhì)酸等進(jìn)行沉積形成骨架結(jié)構(gòu)，便于其他細(xì)胞的遷移。脫細(xì)胞生物敷料治療燙傷創(chuàng)面的各個(gè)階段不是孤立的，而是相互重疊，相互交錯(cuò)，在機(jī)體的調(diào)控下有序、完整地進(jìn)行著。

脫細(xì)胞生物敷料生物相容性好，避免了多次換藥，能最大限度 地保護(hù)挽救間生態(tài)組織，可以降低超高代謝、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)綜合征和燒傷感染的威脅, 使病程全過程穩(wěn)定，在燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中能夠有效促進(jìn)創(chuàng)面的愈合過程、縮短愈合時(shí)間，且在治療過程中未觀察到炎癥加深、細(xì)菌感染、出血、動(dòng)物死亡等不良反應(yīng)，一定程度上說明該脫細(xì)胞生物敷料安全性和有效性良好，為燒傷提供一種較為理想的皮膚修復(fù)方式，也為進(jìn)一步臨床試驗(yàn)提供了理論支持和試驗(yàn)依據(jù)。