王菲迪，王莉，吳聲敢，蔣金花，柳新菊，安雪花，呂露，趙學(xué)平

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點實驗室(籌)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室，浙江 杭州 310021)

14-羥基蕓苔素甾醇是一種結(jié)構(gòu)新穎的油菜素甾醇(Brassinosteroid，BRs)激素。BRs是一類多羥基的類固醇植物激素，被譽為繼生長素、乙烯、脫落酸、赤霉素、細胞分裂素后的第六類植物內(nèi)源性激素[1]。BRs能夠調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，具有高效、廣譜、無毒的特點，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[1]。14-羥基蕓苔素甾醇制備時主要以花粉為原料，采用酶法水解萃取進行提取、分離和純化，具有良好的蕓苔素內(nèi)酯活性[1]。14-羥基蕓苔素甾醇分子式為C27H46O7，化學(xué)名稱為(20R，22R)-2β，3β，14，20，22，25-六羥基-5β-6-酮。包括14-羥基蕓苔素甾醇在內(nèi)的BRs分子中缺乏對光、電高響應(yīng)的官能團，且揮發(fā)性差，較難離子化[2]。檢測時，最常見的思路是利用甾醇分子中特征的順式鄰二羥基與烴基硼酸結(jié)合，引入生色團或電活性基團，再利用質(zhì)譜、紫外、熒光或電化學(xué)檢測器進行檢測[2]。衍生化操作繁瑣，不經(jīng)衍生化直接用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)可對14-羥基蕓苔素甾醇直接進行檢測。吳進龍等[3]以萘硼酸為衍生化試劑，以甲醇為溶劑進行衍生化反應(yīng)，采用HPLC-DAD對衍生化產(chǎn)物進行檢測，此法定量限(LOQ)為25.0 mg·L-1。其團隊還采用HPLC-ELSD對14-羥基蕓苔素甾醇直接進行檢測，LOQ為16.1 mg·L-1[4]。根據(jù)報道，其他種類蕓苔素甾醇的分析方法也通常著眼于生物檢測、衍生化分析和免疫分析等手段，但生物檢測穩(wěn)定性差，難以準(zhǔn)確定量，衍生化方法操作繁瑣，免疫分析成本高，且高度轉(zhuǎn)移[2]。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法(UPLC-MS/MS)具有高效、分離度高、靈敏度高等特點，是蕓苔素甾醇檢測技術(shù)發(fā)展的一個趨勢。本研究通過UPLC-MS/MS，建立更靈敏、選擇性更高的分析方法，旨在為蕓苔素甾醇的分析檢測提供一定的研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ABSciex液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Exion LCAD-Triple QuadTM 5500，美國ABSciex公司)；CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm，美國Waters公司)；BSA224S 電子天平(感量0.000 1 g，德國賽多利斯集團)；MX-S可調(diào)式混勻儀(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)。

14-羥基蕓苔素甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%，成都新朝陽作物科學(xué)有限公司)；色譜純乙腈(德國Merck公司)；色譜純甲酸和色譜純乙酸銨(Anaqua Chemicals Supply公司)；飲用純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量14-羥基蕓苔素甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，配成濃度為1.19×103mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用乙腈逐級稀釋，得到濃度為10.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.010和0.005 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

取5.0 mL水樣，加入5.0 mL乙腈，渦旋1 min混勻。用乙腈將混勻后的溶液稀釋5倍，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.3.2 檢測條件

液相條件。色譜柱CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm，美國Waters公司)。流動相：A為0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：起始比例A為5%；0～0.5 min，A維持5%；0～0.5 min，A升至30%，然后維持至3.5 min；3.5～4.0 min，恢復(fù)至起始梯度平衡系統(tǒng)，維持至6.0 min。流速0.25 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣體積5.00 μL；峰面積外標(biāo)法定量。

質(zhì)譜條件。毛細管電壓-4.5 kV，氣簾氣35 psi，噴撞氣7 psi，噴霧氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子源溫度550 ℃，射入電壓-10 V，碰撞室射出電壓-16 V。定性、定量模式均為MRM多反應(yīng)監(jiān)測模式，電離方式為ESI-。14-羥基蕓苔素甾醇的定量離子對(去簇電壓、碰撞能)為m/z541.2>159.2(-100 V，-40 V)，定性離子對(去簇電壓、碰撞能)為m/z541.2>347.5(-100 V，-36 V)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

14-羥基蕓苔素甾醇分子中缺乏對光、電高響應(yīng)的官能團，較難離子化，因此質(zhì)譜檢測時母離子和子離子的確定很困難。分別在ESI+和ESI-兩種電離方式下對14-羥基蕓苔素甾醇的母離子進行掃描，最終確認母離子為[M+CH3COO-]的離子，常見的[M+H+]和[M+Na+]等信號均較弱，然后確定子離子，優(yōu)化了碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別考察ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱、CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱及ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱對14-羥基蕓苔素甾醇的分離分析性能。14-羥基蕓苔素甾醇極性較大，在ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱和ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱上基本無保留，1 min內(nèi)就出峰，且穩(wěn)定性差，故最終選擇適合分離分析極性化合物的CORTECS?UPLC?HILIC色譜柱。

考察乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液、乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液及甲醇-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液等流動相對14-羥基蕓苔素甾醇的色譜峰形和響應(yīng)值的影響。最終確定流動相為乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，在該流動相體系下，色譜峰形相對較好且穩(wěn)定。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

分別采用了乙酸乙酯提取、二氯甲烷提取、乙腈提取和乙腈定容的方法進行了添加回收試驗。結(jié)果表明，乙酸乙酯提取、二氯甲烷提取和乙腈提取方法的回收率均較低，未能滿足農(nóng)藥檢測要求，而乙腈定容后再稀釋的方法的添加回收率滿足檢測要求。因此，最終選擇了乙腈定容的前處理方法對14-羥基蕓苔素甾醇進行檢測。

2.4 方法的線性范圍

將0.005、0.010、0.050、0.100和0.200 mg·L-1的14-羥基蕓苔素甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進儀器進行檢測。以濃度為橫坐標(biāo)，分別對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，得到回歸方程為y=279 012x+1 521，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 7，表明14-羥基蕓苔素甾醇在0.005～0.200 mg·L-1濃度線性良好。

2.5 方法的準(zhǔn)確度、精密度和定量限

在不含14-羥基蕓苔素甾醇的空白水樣中，通過添加回收試驗，考察了方法的準(zhǔn)確度和精密度(n=5)。表1表明，14-羥基蕓苔素甾醇在0.1、1.0、11.9 mg·L-1添加水平下，平均回收率在101%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.29%～5.82%，滿足檢測分析的要求。根據(jù)添加回收，確定14-羥基蕓苔素甾醇的定量限(LOQ)為0.1 mg·L-1。

表1 14-羥基蕓苔素甾醇的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 小結(jié)

本研究建立了14-羥基蕓苔素甾醇的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，該方法簡單、快速、高效、靈敏，檢出限最低可到0.1 mg·L-1，能夠滿足14-羥基蕓苔素甾醇殘留量的檢測要求，為蕓苔素甾醇的分析方法提供了一定的研究思路。但今后仍需發(fā)展更為靈敏的檢測方法，如發(fā)展操作簡易、響應(yīng)靈敏的新型衍生化試劑，與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，為蕓苔素甾醇這類新型植物生長調(diào)節(jié)劑的風(fēng)險監(jiān)控提供強有力的支持。