曾藩韜，余東升

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔科，廣東 廣州（510260）；2.中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·光華口腔醫(yī)學(xué)院·廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州（510055）

近年來(lái)口腔鱗癌及其他惡性腫瘤相關(guān)研究有了一定進(jìn)展，但是口腔鱗癌患者的預(yù)后沒(méi)有明顯的改善，口腔鱗癌的5年生存率在過(guò)去30年中仍保持在55%～60%左右［1］。因此進(jìn)一步探索口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及潛在分子靶點(diǎn)在口腔鱗癌研究中十分重要。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種以共價(jià)配對(duì)形成的環(huán)狀非編碼RNA分子，其不具有游離5’端帽子和3’端poly尾巴，前體RNA可變剪接后直接成環(huán)，且不被核酸外切酶RNase R降解［2］。環(huán)狀RNA也被發(fā)現(xiàn)與多種人類疾病有關(guān)，例如癌癥和自身免疫性疾病等，這提示環(huán)狀RNA可能成為新的腫瘤分子標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。在口腔鱗癌中，Chen等［3］發(fā)現(xiàn)circ_100290在口腔鱗癌中異常高表達(dá)，其可以海綿性吸附miR-29家族成員來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)水平，并最終影響了口腔鱗癌細(xì)胞在體內(nèi)及體外的增殖能力。但口腔鱗癌中circ_0001273的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討circ_0001273對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，為口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供了新的研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

口腔鱗癌及癌旁組織來(lái)源中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院2018年收集病例；本研究獲得中山大學(xué)附屬附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)?？谇击[癌UM1和CAL27細(xì)胞株（ScienCell，美國(guó)）；circ_0001273 siRNA由上海吉瑪生物設(shè)計(jì)并合成；Trizol Universal（天根生化，中國(guó)）；cell Titer 96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑（Promega，美國(guó)）；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板及Matrigel膠（BD，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；ABI7500熒光PCR儀（ABI，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

口腔鱗癌UM1細(xì)胞株在含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）中培養(yǎng)；口腔鱗癌CAL27細(xì)胞株在含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）中培養(yǎng)。置于37℃、5%CO2和95%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每48 h換液傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞傳代，使其融合度為40%左右。吸去完全培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍后每孔加入1 mL 20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。用無(wú)RNA酶的去離子水溶解siRNA使其濃度用20μM，再將其溶于500μL opti-MEM培養(yǎng)基中。另取5μL LipofectaminRNAiMAX混勻于500μL opti-MEM培養(yǎng)基中。將兩份液體混勻后靜置20 min即可分別加入各細(xì)胞培養(yǎng)孔中。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱4～6 h后，即可換為正常培養(yǎng)基。

1.4 qRT-PCR

提取總RNA，在無(wú)RNA酶的PCR管中加入1μg總RNA及11μL純水，混勻后至于85℃保溫5 min，使RNA變性，隨后立即置于冰上，以防RNA復(fù)性，隨后在此PCR管中加入0.5μL Oligo（dT）、0.5μL Random primer、2μL 10 mM dNTP、RNase inhibitor、5×buffer及M-MLV，混勻后置于30℃保溫10 min，置于42℃60 min，置于85℃10 min。逆轉(zhuǎn)錄完成后，在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)條件為50℃2 min、95℃2 min、95℃15 s、60℃32 s、40個(gè)循環(huán)，并于60℃～95℃分析熔解曲線。引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 細(xì)胞增殖

消化細(xì)胞后將細(xì)胞吹打散開(kāi)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，96孔板中每孔100μL即1×104個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，收集0、12、24、48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，加入MTS試劑，每100μL培養(yǎng)基加入10μL檢測(cè)試劑。孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀讀板，讀取OD490數(shù)據(jù)。

1.6 細(xì)胞遷移

細(xì)胞計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，使用100μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell小室的上室，并在下室加入600μL完全培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min后PBS緩沖液洗1次，結(jié)晶紫染色10 min后PBS緩沖液洗1次，拍照統(tǒng)計(jì)細(xì)胞穿過(guò)小孔的數(shù)量。

1.7 細(xì)胞侵襲

4℃溶解Matrigel膠過(guò)夜，后預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶3體積比稀釋Matrigel膠，取40μL加入預(yù)冷的Transwell小室中，37℃孵育2 h，使Matrigel膠凝固。吸走Transwell小室中多余的液體，在上室加入100μL無(wú)血清培養(yǎng)基，在下室加入600μL無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜。每組細(xì)胞計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，使用100μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell小室的上室，并在下室加入600μL完全培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min后PBS緩沖液洗1次，結(jié)晶紫染色10 min后PBS緩沖液洗1次，拍照統(tǒng)計(jì)細(xì)胞穿過(guò)小孔的數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)

2結(jié)果

2.1 12例組織中檢測(cè)3種circRNA表達(dá)水平結(jié)果

在12例口腔鱗癌及癌旁組織中，相對(duì)于癌旁組織，circ_0001273（t＝9.054）、circ_0018569（t＝5.306）、circ_0027152（t＝7.232）3種circRNA在口腔鱗癌組織中均顯著高表達(dá)（P＜0.05），其中circ_0001273差異最為顯著，平均差異為8.5倍（圖1）。

Figure 1 Relative expression of circ_0001273,circ_0018569,circ_0027152 in 12 oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues圖1 12例口腔鱗癌及癌旁組織中circ_0001273，circ_0018569，circ_0027152的相對(duì)表達(dá)

2.2 敲低circ_0001273后口腔鱗癌細(xì)胞株中circ_0001273的表達(dá)水平

UM1及CAL27細(xì)胞株中分別轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA后，circ_0001273表達(dá)水平如圖2所示。和轉(zhuǎn)染siRNA NC的細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染siRNA的UM1（t＝50.408）及CAL27（t＝23.556）中circ_0001273表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），circ_0001273 siRNA敲低對(duì)UM1細(xì)胞株中circ_0001273表達(dá)的抑制率為73%，對(duì)CAL27細(xì)胞株的抑制率為80%。

2.3 敲低circ_0001273對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞株增殖功能的影響

UM1及CAL27細(xì)胞株中分別轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA后，各組細(xì)胞增殖能力如圖3所示。和轉(zhuǎn)染siRNA NC的細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞組UM1（t＝14.735）及CAL27（t＝23.383）增殖能力顯著降低（P＜0.05）。

Figure 2 Relative expression of circ_0001273 in 4 groups of oral squamous cell carcinoma cells after knockdown of circ_0001273圖2 敲低circ_0001273后4組口腔鱗癌細(xì)胞中circ_0001273的相對(duì)表達(dá)

Figure 3 Effect of circ_0001273 siRNA on the proliferation of UM1 and CAL27 cells圖3 circ_0001273 siRNA對(duì)UM1及CAL27細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 敲低circ_0001273對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞株遷移功能的影響

UM1及CAL27細(xì)胞株中分別轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA后，各組細(xì)胞遷移水平如圖4所示。和轉(zhuǎn)染siRNA NC的細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞組UM1（t＝34.641）及CAL27細(xì)胞株（t＝60.622）細(xì)胞遷移能力表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。

2.5 敲低circ_0001273對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞株侵襲功能的影響

UM1及CAL27細(xì)胞株中分別轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA，各組細(xì)胞侵襲水平如圖5所示。和轉(zhuǎn)染siRNA NC的細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞組UM1（t＝22.17）及CAL27（t＝33.005）細(xì)胞侵襲能力均顯著降低（P＜0.05）。

Figure 4 Effect of circ_0001273 siRNA on the migration ability of UM1 and CAL27 cells圖4 circ_0001273 siRNA對(duì)UM1及CAL27細(xì)胞株遷移能力的影響

Figure 5 Effect of circ_0001273 siRNA on the invasion ability of UM1 and CAL27 cells圖5 circ_0001273 siRNA對(duì)UM1及CAL27細(xì)胞侵襲能力的影響

3討論

circRNA早期被認(rèn)為是一類基因剪切副產(chǎn)物而沒(méi)有實(shí)際作用，如今被發(fā)現(xiàn)與多種人類疾病相關(guān)，如骨關(guān)節(jié)炎［4］、自身免疫疾?。?］及動(dòng)脈粥樣硬化［6］等。研究表明circRNA可以海綿式吸附miRNAs，以此阻止miRNA對(duì)mRNA的抑制效果［7］，并且circRNA能夠作為腫瘤的生物標(biāo)志物［8］。circRNA成為了近幾年腫瘤研究中的熱門研究對(duì)象，在胃癌［9］、骨肉瘤［10］、肺腺癌［11］、肝癌［12］、食管鱗癌［13］及三陰性乳腺［14］中，均有相關(guān)circRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。而在口腔鱗癌中，有研究用TNF-α誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞株CAL27構(gòu)建凋亡模型，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并在細(xì)胞模型上驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)circDOCK1可以靶向結(jié)合miR-196a-5p，間接調(diào)控了miR-196a-5p的靶基因BIRC3，從而抑制了口腔鱗癌細(xì)胞凋亡［15］。結(jié)合circ_0001273在口腔鱗癌中高表達(dá)的情況，circ_0001273可能的作用機(jī)制是與促癌基因競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA，海綿式吸附miRNA導(dǎo)致促癌基因的活化，從而參與了口腔鱗癌的發(fā)生。

目前circRNA在口腔鱗癌的相關(guān)研究仍然較少，因此繼續(xù)探索口腔鱗癌相關(guān)circRNA的研究十分重要。本研究在12例口腔鱗癌及癌旁組織中通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了circ_0001273、circ_0018569、circ_0027152三個(gè)circRNA，并選取了差異最大的circ_0001273來(lái)進(jìn)行后續(xù)研究，實(shí)際上另兩個(gè)circRNA也在口腔鱗癌中異常高表達(dá)（P＜0.05），也是值得進(jìn)一步研究的。研究中發(fā)現(xiàn)circ_0001273的高表達(dá)，提示circ_0001273可能是口腔鱗癌的生物標(biāo)志分子，進(jìn)一步研究需要加大樣本量，并可以在患者外周血中進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證其作為口腔鱗癌生物標(biāo)志物的潛力。敲低circ_0001273可以使口腔鱗癌細(xì)胞株UM1及CAL27的增殖、遷移及侵襲能力顯著下降（P＜0.05），這提示circ_0001273可能參與了促進(jìn)口腔鱗癌腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，然而circ_0001273對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞具體的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

敲低circ_0001273可以抑制口腔鱗癌細(xì)胞株中的增殖、遷移及侵襲，表明其在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用，circ_0001273可能成為新的口腔鱗癌治療靶點(diǎn)。