孫健瑋，王劍松，劉子超，鄭立民

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院超聲科，云南個舊 661000；2）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，云南昆明 650101；3）昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系，云南昆明 650214；4）昆明醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科，云南個舊 661000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）多發(fā)于老年男性，其發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢[1]，大多數(shù)病例由于內(nèi)分泌治療產(chǎn)生抵抗而出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡。目前尚缺乏PCa 早期診斷的分子生物學(xué)檢測標(biāo)記物以及治療的分子靶向藥物，對PCa 發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究已成為熱點。

PCa 的發(fā)生發(fā)展受多基因及多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatease and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）屬于抑癌基因，多種腫瘤的發(fā)生與其表達(dá)水平降低或丟失關(guān)系密切[2]。多種原因?qū)е碌腜TEN 基因表達(dá)減低或缺失可經(jīng)由多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響PCa 的發(fā)生發(fā)展[3]。細(xì)胞凋亡（apoptosis）也稱程序性細(xì)胞死亡，此過程以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定為目的，是腫瘤細(xì)胞生存的重要影響因素之一，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。作為真核細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)途徑之一的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以高度保守的三級激酶級聯(lián)形式激活并在磷酸化狀態(tài)下將上游信號傳遞到下游應(yīng)答分子，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮重要的作用，Raf-1 即為該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要節(jié)點之一。PTEN 基因?qū)?xì)胞凋亡的調(diào)控是否與MAPK 信號通路中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵位點Raf-1 有關(guān)尚不能確定。本研究通過改變PTEN 基因表達(dá)，檢測磷酸化Raf-1水平并抑制相關(guān)信號通路中Raf-1 的上游作用點，再對PC3 細(xì)胞凋亡進(jìn)行測定，旨在探討PTEN 基因的表達(dá)對Raf-1 磷酸化的調(diào)控作用并進(jìn)一步對前列腺癌PC3 細(xì)胞凋亡的影響，為PCa 的臨床診治應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

前列腺癌PC3 細(xì)胞購自中國科學(xué)院典藏委員會昆明細(xì)胞庫；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX Reagent 和Opti-MEM I Medium培養(yǎng)基購自美國Invitrogen 公司；PTEN-pCMV6 載體購自美國Origene 公司；si-PTEN RNA 購自Qiagen 公司；PTEN 抗體（GTX101025）購自美國GeneTex 公司；Caspase-8 抗體（8CSP03）、Caspase-9（96-1-23）、Caspase-3 抗體（3CSP01）購自美國CST 公司，Caspase-12 抗體（D-20）購自美國Abcam 公司；Bax 抗體（2D2）和Bcl-2 抗體（C-2）購自美國Santa Cruz 公司；β-tubulin 抗體購自美國Epitmics 公司；FTS 和MK2206 2HCl 分別購自美國Sigma 公司和Selleck 公司；MTT 試劑盒、碘化丙啶購自美國BD 公司；胎牛血清購自Gibco 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、10 ng/mL EGF和1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基，PC3 細(xì)胞在37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)，2～3 d 更換培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)期細(xì)胞用于實驗。

1.3 細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染

在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入500 μL 對數(shù)期細(xì)胞懸液（1×105個/孔），過夜培養(yǎng)后加入FTS（150 μmol/L）和MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用48 h 后以Western Blot 檢測ERK 和AKT 表達(dá)程度，以空白抑制劑組作對照。8 μg PTEN-pCMV6 載體質(zhì)粒和10 μL 的Lipofectamine 2000 分別用250 μL的Opti-MEM 稀釋，放置5 min 后混勻，再室溫放置25 min 后加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，6 h 后換成完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后用Western Blot 檢測PTEN 基因表達(dá)水平和磷酸化Raf-1 表達(dá)水平。光鏡下觀察PC3 細(xì)胞形態(tài)、MTT 檢測細(xì)胞活力、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；Western Blot 檢測Bax、BCL-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3表達(dá)水平。空質(zhì)粒做對照。

1.4 細(xì)胞的干擾

在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入500 μL對數(shù)期細(xì)胞懸液（2×105個/孔），過夜培養(yǎng)后加入FTS（150 μmol/L）和MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用48 h 后以Western Blot 檢測ERK 和AKT 表達(dá)程度，以空白抑制劑組作對照。0.7 μL 的20 μM si-PTEN RNA 及1 μL Lipofectamine RNAiMAX 分 別 用50 μL的Opti-MEM稀釋放置5 min 后混勻，在室溫放置18 分鐘后加入到24 孔板中并加200 μL 的opti-MEM，6 h 后換成含完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h 后用Western Blot 檢測PTEN 基因表達(dá)程度和磷酸化Raf-1 表達(dá)水平。光鏡下觀察PC3 細(xì)胞形態(tài)、MTT檢測細(xì)胞活力、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；Western Blot 檢測Bax、BCL-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 表達(dá)水平。control siRNA 做對照。

1.5 Western blot 檢測

各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用胰酶消化后，加入細(xì)胞裂解液裂解并離心提取蛋白質(zhì)，Bio-rad 蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。等量的總蛋白經(jīng)煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%奶粉溶液封閉2 h，一抗孵育過夜，二抗孵育4 h，滴加適量ECL 化學(xué)發(fā)光底物，顯影。采用Quantity One 軟件測定條帶灰度值。實驗重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ERK 和AKT 表達(dá)的測定

Ras 抑制劑FTS（150 μmol/L）和AKT 抑制劑MK2206 2HCl（3 μmol/L）作 用PC3 細(xì) 胞48 h，Western Blot 檢測ERK 和AKT 表達(dá)量分別較空白抑制劑對照組減低49.80%（P＜0.01）和51.62%（P＜0.001），見圖1C-圖C。

圖1 ERK 和AKT 表達(dá)的測定Fig.1 The expression of ERK and AKT

2.2 PTEN 基因表達(dá)和Raf-1、磷酸化Raf-1 表達(dá)的測定

以載體質(zhì)粒PTEN-pCMV6 經(jīng)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染PC3 細(xì)胞，48 h 后進(jìn)行Western Blot 檢測，PTEN 基因表達(dá)量較對照組顯著增加（P＜0.01）；磷酸化Raf-1 表達(dá)量Raf-1 顯著降低（P＜0.01）；Raf-1 表達(dá)量與對照組無明顯差異（P=0.95），見圖2。

以 si-PTEN 干 擾 RNA 經(jīng) Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染PC3 細(xì)胞，48 h 后進(jìn)行Western Blot 檢測，PTEN 基因表達(dá)量分別較對照組顯著減少（P＜0.05）；磷酸化Raf-1 表達(dá)量顯著增加Raf-1（P＜0.01）；Raf-1 表達(dá)量與對照組無明顯差異（P=0.34），見圖3。

2.3 PTEN 基因表達(dá)變化對PC3 細(xì)胞凋亡的影響

FTS（150 μmol/L）和 MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用PC3 細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染過表達(dá)和干擾48 h 后對PC3 細(xì)胞凋亡的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。

2.3.1 PC3 細(xì)胞光鏡下形態(tài)變化 PTEN 過表達(dá)后，光鏡下見PC3 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的改變，表現(xiàn)為細(xì)胞變形，體積縮小，細(xì)胞核固縮。干擾PTEN 表達(dá)減少后，光鏡下PC3 細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目以及體積、細(xì)胞核形態(tài)的變化無顯著差異，見圖4。

圖2 PTEN 過表達(dá)時Raf-1 和磷酸化Raf-1 的表達(dá)Fig.2 The expression of Raf-1 and phosphorylated Raf-1 when PTEN was overexpressed

圖3 PTEN 干擾時Raf-1 和磷酸化Raf-1 的表達(dá)Fig.3 The expression of Raf-1and phosphorylated Raf-1 when PTEN was silenced

圖4 PTEN 基因表達(dá)變化PC3 細(xì)胞凋亡的光鏡下表現(xiàn)（×200）Fig.4 The apoptosis of PC3 when PTEN's expression was changed（×200）

2.3.2 MTT 測定PC3 細(xì)胞OD 值和細(xì)胞活力PTEN 過表達(dá)和干擾時，MTT 測定PC3 細(xì)胞OD 值分別為（0.354±0.048）和（0.690±0.084），計算細(xì)胞活力分別為（41.42±2.88）%和（95.36±7.75）%。與各對照組相比較，PTEN 基因過表達(dá)時PC3 細(xì)胞活力減低（P＜0.01），PTEN 基因干擾時PC3 細(xì)胞活力變化無顯著差異（P=0.41）。

2.3.3 Annexin V-FITC 和PI 雙染色流式細(xì)胞儀檢測PC3 細(xì)胞凋亡率 PTEN 過表達(dá)時，PC3 細(xì)胞凋亡率為（22.10±2.29）%，較對照組（6.37±0.76）%增高（P＜0.01）。PTEN 干擾時，PC3 細(xì)胞凋亡率為（7.47±0.74）%，與對照組（6.57±0.78）%比較無顯著差異（P=0.22），見圖5。

2.3.4 Western blot 測 定 Bax、Bcl-2、caspase-8、caspase-9、caspase-12 和caspase-3的表達(dá)水平 PTEN 過表達(dá)時，促凋亡蛋白Bax 以及凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 的表達(dá)量較對照組增高（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平較對照組減低（P＜0.01）。PTEN 基因干擾時，促凋亡蛋白Bax 以及凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 的表達(dá)量較對照組減低（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平較對照組增高（P＜0.01），見圖6。

圖5 PTEN 基因表達(dá)變化流式細(xì)胞儀檢測PC3 細(xì)胞凋亡率Fig.5 The apoptosis rate of PC3 by flow cytometer when PTEN's expression was changed

圖6 PTEN 基因表達(dá)變化相關(guān)凋亡蛋白及Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)Fig.6 The expression of caspase and Bax/Bcl-2 when PTEN'expression was changed

3 討論

PCa 是近年老年男性發(fā)病率最高的癌癥之一，它具有與雄激素相關(guān)的特性，激素剝奪治療被認(rèn)為是有效的治療手段，但大多數(shù)病例后期治療效果極為有限并最終導(dǎo)致內(nèi)分泌治療抵抗而預(yù)后不佳，因此對PCa 發(fā)病機(jī)制及其治療手段研究成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。

激素非依賴性前列腺癌（androgen independent prostate cancer，AIPC）包括雄激素非依賴性前列腺癌和激素抵抗性前列腺癌，雖經(jīng)過內(nèi)分泌治療仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)和進(jìn)展[5]。除雄激素受體（androgen receptor，AR）表達(dá)異常、配體、共調(diào)節(jié)因子等作用機(jī)制外，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路憑借其重要的生物學(xué)功能在AIPC 的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[6]。目前磷脂酰肌醇3 激酶/ 絲蘇氨酸激酶（PI3K/AKT）和絲裂原激活蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AIPC 發(fā)生機(jī)制中的作用研究較為深入，前者主要與細(xì)胞的存活有關(guān)，可調(diào)控AR 的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性進(jìn)而相互協(xié)同促進(jìn)AIPC 的發(fā)生與發(fā)展[7]，后者主要在細(xì)胞增殖、分化、周期調(diào)控以及細(xì)胞凋亡等方面導(dǎo)致AIPC 的轉(zhuǎn)化[8]。MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Raf分為A-Raf、B-Raf 和C-Raf（Raf-1），被啟動信號Ras 磷酸化的Raf-1 具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，通過激活下游因子MAPK 激酶（MEK1/2）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）進(jìn)而影響胞漿蛋白磷酸化、細(xì)胞骨架成分磷酸化以及胞核轉(zhuǎn)錄因子、核蛋白磷酸化等生物學(xué)過程。該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中自分泌和旁分泌生長因子所導(dǎo)致的Ras 和Raf 激活可推進(jìn)AIPC 的病程進(jìn)展并在PCa 的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[9]。除Ras 外，Raf-1 也可能被其他上游信號蛋白甚至是PI3K/AKT 通路中的AKT所調(diào)控，Raf-1 是PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號通路間相互作用的交匯點之一[10]。

抑癌基因PTEN 具有雙重特異性磷酸酶活性，主要通過細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞遷移等環(huán)節(jié)發(fā)揮抑癌功能，PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的平衡是其調(diào)控作用的關(guān)鍵[11]。PTEN 可特異性誘導(dǎo)細(xì)胞周期素依賴激酶（CDKs）抑制因子p21、p27 和p51 參與細(xì)胞周期的調(diào)控[12]。PTEN 基因表達(dá)的缺失普遍存在于PCa 并增強(qiáng)AR 的激活和表達(dá)而可能成為AIPC 進(jìn)展的關(guān)鍵原因之一[7，13]。

本研究表明，PC3 細(xì)胞分離自人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤，分化程度低，具有AIPC 的特性，當(dāng)使用FTS（Farnesylthiosalicy acid）選擇性抑制Ras 法尼?；D(zhuǎn)移酶活性、MK2206 2HCl 高度選擇性抑制AKT 活性以排除Ras 和AKT 對Raf-1 的干擾，PTEN 基因過表達(dá)時PC3 細(xì)胞的Raf-1 活性出現(xiàn)抑制（即磷酸化Raf-1 表達(dá)減低），PTEN 基因表達(dá)減低后PC3 細(xì)胞Raf-1 的活化增加（即磷酸化Raf-1 表達(dá)增加），而非磷酸化Raf-1 的水平與PTEN 基因的表達(dá)變化無相關(guān)性。提示在MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中除Ras 外，PTEN 基因可對Raf-1 的活化進(jìn)行負(fù)調(diào)控。Raf-1 作為PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間重要的交匯點之一，除接受Ras 和AKT 信號蛋白的激活外也能被PTEN 基因所調(diào)控，成為PTEN 基因在MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中除Ras 外新的作用位點。PTEN 基因?qū)af-1 負(fù)調(diào)控作用有助于揭示AIPC 的發(fā)生機(jī)制，并可為針對PTEN、Ras、Raf-1等信號通路中關(guān)鍵因子進(jìn)行靶點治療提供重要的分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控、程序性死亡的過程，在維持細(xì)胞增殖的動態(tài)平衡以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖方面具有重要的作用。參與細(xì)胞凋亡的三個主要通路包括死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Crysteiny aspartate-specific proteinases，caspase）的激活是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟[14]，不同的Caspase家族成員所發(fā)揮作用不盡相同，其中Caspase-2、Caspase-8 和Caspase-9 在自我活化的同時能識別激活下游信號分子而具有凋亡啟動功能[15-16]，Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 發(fā)揮推進(jìn)和執(zhí)行凋亡過程的作用，Caspase-3 的活化推動細(xì)胞凋亡的不可逆性[17-18]，而caspase-12 則是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志[19]。參與細(xì)胞凋亡的不同通路存在多個交匯點，如Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3 以及Bax/Bcl-2，形成細(xì)胞凋亡復(fù)雜而重要的網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制。細(xì)胞凋亡受多種因素的調(diào)控和影響，其中MAPK 相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對細(xì)胞凋亡具有重要的調(diào)控作用[20]。

原癌基因Bcl-2 的表達(dá)產(chǎn)物具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，Bax 基因編碼的蛋白位于細(xì)胞漿并與Bcl-2 存在21%的同源性，轉(zhuǎn)移至線粒體的Bax 分子中BH3 能與Bcl-2 形成雜二聚體對抗Bcl-2 的凋亡抑制作用進(jìn)而發(fā)揮促凋亡功能[21]。Bax/Bcl-2蛋白間競爭性二聚化作用決定細(xì)胞在接受凋亡信號刺激時是否發(fā)生凋亡，如Bax 和Bcl-2 均衡表達(dá)、Bax/Bcl-2 異二聚體占優(yōu)勢時表現(xiàn)為細(xì)胞存活期正常，若Bax 或Bcl-2 任意一方過表達(dá)所形成的Bax/Bax 或Bcl-2/Bcl-2 同二聚體占優(yōu)勢則出現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或抑制細(xì)胞凋亡的效應(yīng)[22]。Bax 和Bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要影響因素，二者的平衡直接關(guān)系到細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控[23]。

本研究顯示，F(xiàn)TS 和MK2206 2HCl 作用后的PC3 細(xì)胞在PTEN 基因過表達(dá)、Raf-1 活性抑制時，PC3 細(xì)胞光鏡下凋亡的改變明顯增加，同時細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡率增加，凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Caspase-3 以及促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 則呈低表達(dá)；而PTEN 基因干擾低表達(dá)、Raf-1 活性增高后，凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Caspase-3 以及促凋亡蛋白Bax 表達(dá)減低，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)增加，提示PTEN 基因在負(fù)調(diào)控Raf-1磷酸化的同時，誘導(dǎo)并促進(jìn)PC3 細(xì)胞的凋亡，并且在此過程中死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑均有可能參與其中，進(jìn)一步預(yù)示PTEN 基因可能通過對Raf-1 的調(diào)控實現(xiàn)MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的抑制以及促凋亡和抗凋亡因素平衡的調(diào)整以誘導(dǎo)并促進(jìn)PC3 細(xì)胞的凋亡。本研究中PTEN 基因干擾后其表達(dá)減低，在光鏡下未觀察到PC3 細(xì)胞形態(tài)的明顯變化，同時PC3 細(xì)胞活力測定值和細(xì)胞凋亡率與對照組比較無顯著變化，提示PTEN 基因干擾表達(dá)減低時雖有促凋亡的因素減少和抗凋亡的因素的增多，但決定PC3 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡抑制效應(yīng)是否還存在Bax/Bcl-2 表達(dá)比例以及其他相關(guān)的影響因素，有待于進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果提示PTEN 基因?qū)APK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Raf-1 具有負(fù)調(diào)控作用并進(jìn)一步影響PC3 細(xì)胞的凋亡過程。針對包括Raf-1 在內(nèi)的MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號蛋白以及Caspase 家族、Bax/Bcl-2 等凋亡因子，可為PCa 和AIPC 診治新靶點的研究提供理論基礎(chǔ)。盡管本研究根據(jù)細(xì)胞凋亡信號因子作用的相關(guān)順序和作用模式可對PC3 細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行一定的推斷，但細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路內(nèi)部和通路之間存在交匯和重疊，凋亡因子之間也存在復(fù)雜的交互作用，MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中MEK/ERK 等其他重要信號蛋白是否參與PC3 細(xì)胞的凋亡，PC3 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和進(jìn)程中各關(guān)鍵因子全面、精準(zhǔn)的作用模式和作用位點有待進(jìn)一步完善研究。