孫孔春，吳樂艷，侯雯清，楊璨瑜，唐艷梅，沈報春

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明 650500；2）云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650100）

三七[Panax notoginseng（burk.）F.H.Chen]又名田七，為五加科人參屬植物，是我國傳統(tǒng)的名中藥材，具有散血止瘀、消腫定痛等功效，并有著“金不換”等美譽(yù)[1]。其性味甘、微苦、溫，主要用于治療咯血、外傷出血、跌打腫痛[2]。三七用于治療疾病有悠久的歷史，在《本草綱目》以前的《醫(yī)門秘旨》、《跌損妙方》中已有記載[3]。藥理資料證明[4-6]，三七在血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、及抗炎、抗衰老、抗腫瘤等方面具有廣泛的藥理作用[7-14]。

三七主要有效成分為皂苷類化合物，隨著現(xiàn)代分析測試儀器的廣泛使用，使得對三七中皂苷類成分的提取、分離、鑒定及含量測定方法的研究取得極大進(jìn)展。當(dāng)前，已經(jīng)從三七中分離提純出近30種皂苷類成分，諸如Ginsenoside Rb1，Ginsenoside Rg1及Ginsenoside F2等[15]。

主要皂苷成分的含量是衡量三七藥材品質(zhì)的重要指標(biāo)。2015 版《中國藥典》[1]一部，三七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定“按干燥品計算，含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的總量不得少于5.0%”。因云南文山是公認(rèn)的三七道地產(chǎn)區(qū)，云南省其他三七種植地也大多在文山州的周邊地區(qū)，如紅河、普洱、曲靖、昆明、玉溪等地[9]。為了考察云南其他產(chǎn)地的三七能否達(dá)到藥典規(guī)定藥用要求，本實驗選取云南省不同產(chǎn)地21 批三七藥材，對這3 種指標(biāo)皂苷進(jìn)行含量測定，檢測云南不同產(chǎn)地三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1之和是否達(dá)到《中國藥典》含量要求。

中藥指紋圖譜不僅具備個體的絕對唯一性，更強(qiáng)調(diào)的是物種特征的唯一性與同種個體之間的相似性。其以整體性以及模糊性等分析特點成為現(xiàn)階段全面、整體控制中藥質(zhì)量最有效的方法，能全面反映中藥所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，被國際社會認(rèn)可，為中藥及其產(chǎn)品進(jìn)入國際市場奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀：包括G1332A真空脫氣機(jī)、G1232C 二元泵、G1329B 標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱、G1315D 檢測器及Agilent 1200LC；色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；電子天平（BSA124S）：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超聲清洗儀（SK3200H）：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；0.22 μm 尼龍微孔濾頭：天津市津騰試驗設(shè)備有限公司；一次性使用無菌注射器5 mL、2.5 mL：陜西龍康鑫醫(yī)療器械有限公司；20 μL、100 μL、200 μL及1 000 μL 移液槍：Eppendorf Research plus。

1.2 實驗樣品及試劑

甲醇（分析純，江蘇漢邦科技有限公司）、乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）、三蒸水、磷酸（成都化夏化學(xué)試劑有限公司），三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1（上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)）；云南省各地三七藥材根及根莖21 份，經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院劉毅教授鑒定為三七藥材根及根莖。

1.3 對照品及供試品溶液的制備

1.3.1 對照品溶液的配制 取三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，分別用60%甲醇超聲溶解，均配制成濃度為1 mg/mL 的溶液，0.22 μm 微孔濾頭過濾，取續(xù)濾液，作為對照品儲備液。

1.3.2 供試品溶液的配制 將各產(chǎn)地的三七樣品粉碎過四號篩，取樣品約1 g，精密稱定，置150 mL 具塞錐形瓶中加入50 mL 60%甲醇，精密稱重，封口，置于超聲震蕩儀中超聲30 min 使各皂苷成分浸出，取出放冷至室溫，稱重用60%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，0.22 μm 微孔濾頭濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

1.4 正交實驗

依據(jù)前期單因素試驗的結(jié)果，選取各因素中對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb13 種目標(biāo)產(chǎn)物提取效果有意義的水平做正交試驗，確定最佳的提取條件。采用L9(34)正交表，以提取時間（A）、料液比（B）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（C）作為3 個考察因素，選取3 個水平進(jìn)行試驗。正交試驗設(shè)計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 方法學(xué)研究

1.5.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25℃；以乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2。在此色譜條件下，取皂苷對照品和采自云南省文山丘北的三七樣品分別進(jìn)樣分析。

表2 HPLC 梯度洗脫程序表Tab.2 The HPLC gradient elution procedures

1.5.2 線性關(guān)系的考察 精確稱取三七皂苷R1對照品，按照1.3.1 下方法配制得到0.0625 mg/mL 的對照品溶液，再按2.2.1 下色譜條件分別進(jìn)樣5、10、20、40、80 μL，記錄保留時間和峰面積；精確稱取人參皂苷Rb1對照品，按照1.3.1 下方法配制為0.25 mg/mL 的對照品溶液，再按2.2.1 下色譜條件分別進(jìn)樣10、20、25、30、35 μL，記錄保留時間和峰面積；精確稱取人參皂苷Rg1對照品，按照1.3.1 下方法配制為0.25 mg/mL 的對照品溶液，再按2.2.1 下色譜條件分別進(jìn)樣5、20、40、50、60 μL，記錄保留時間和峰面積。

1.5.3 精密度和重復(fù)性試驗 精密吸取1.3.2 下方法配制的同一份供試樣品溶液，按2.2.1 下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄3 種有效成分的保留時間及峰面積；取同一份供試藥材，按1.3.2 下方法平行操作制備5 份樣品，分別按2.2.1 下色譜條件進(jìn)樣，記錄3 種有效成分的保留時間及峰面積，計算各物質(zhì)保留時間和峰面積的RSD%，分別考察改方法的精密度和重復(fù)性。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗 按1.3.2 下方法配制供試樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按2.2.1 下色譜條件進(jìn)樣10 μL 測定，記錄3 種有效成分的保留時間及峰面積，計算各物質(zhì)的保留時間和峰面積的RSD%。

1.5.5 回收率 向已知被測成分含量的三七樣品供試品中，精密加入一定量的被測成分對照品，計算實測值與供試品中含有量之差，再除以加入對照品量計算回收率。

1.6 樣品含量測定

取云南不同產(chǎn)地的21 份三七樣品，分別按1.3.2 下方法配制成供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄保留時間及峰面積，將所得結(jié)果帶入3 種皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算云南不同產(chǎn)地三七樣品中3 種皂苷的含量。

1.7 HPLC 指紋圖譜建立

將各產(chǎn)地批次三七樣品按1.3 下方法配制成供試品溶液，按2.2 方法下高效液相色譜實驗條件進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行分析，記錄色譜圖。選取參照峰（S），記錄樣品出峰總個數(shù)及共有峰個數(shù)，計算共有峰的相對保留時間，相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。

2 結(jié)果

2.1 正交實驗結(jié)果

按表1 的正交因素水平表設(shè)計正交試驗，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的正交實驗結(jié)果及方差分析結(jié)果分別列于表3 至表8。

由表3～表8 的極差結(jié)果及方差結(jié)果可以看出：對于三七皂苷R1、人參皂苷Rg1以及人參皂苷Rb1而言，3 個因素中對其提取量的影響大小依次為料液比（B）＞甲醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞提取時間（A），在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，得到三七皂苷R1的最佳提取工藝A2B3C1，即提取時間30 min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇體積分?jǐn)?shù)60%；人參皂苷Rg1的最佳提取工藝是A3B3C1，即提取時間45 min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇體積分?jǐn)?shù)60%；人參皂苷Rb1的最佳提取工藝是A2B3C1，即提取時間30 min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇體積分?jǐn)?shù)60%。

綜合3 種物質(zhì)的提取工藝，最終選擇超聲提取時間30 min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇體積分?jǐn)?shù)60%為超聲同時提取三七中有效成分的最佳提取工藝。

2.2 方法學(xué)研究結(jié)果

2.2.1 三七中各皂苷及樣品HPLC 色譜圖 按對照品及供試品溶液配制方法操作，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品溶液色譜圖見圖1，采自文山丘北三七樣品色譜圖見圖2。理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計在6×103以上；各皂苷與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5。

表3 L9（34）正交試驗結(jié)果（三七皂苷R1）Tab.3 The results of orthogonal experiment（Panax Notoginseng Saponins R1）

表4 三七皂苷R1正交實驗方差分析表（α=0.05）Tab.4 Analysis of orthogonal experiment variance of Panax Notoginseng Saponins R1（α=0.05）

表5 L9（34）正交試驗表（人參皂苷Rg1）Tab.5 The results of orthogonal experiment（Ginsenoside Rg1）

表6 人參皂苷Rg1正交實驗方差分析表（α=0.05）Tab.6 Analysis of orthogonal experiment variance of Ginsenoside Rg1（α=0.05）

表7 L9（34）正交試驗表（人參皂苷Rb1）Tab.7 The results of orthogonal experiment(Ginsenoside Rb1）

表8 人參皂苷Rb1正交實驗方差分析表（α=0.05）Tab.8 Analysis of orthogonal experiment variance of Ginsenoside Rb1（α=0.05）

圖1 三七皂苷混標(biāo)色譜圖Fig.1 The chromatograms of Panax Notoginseng Saponins

圖2 三七樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of the panax notogiseng sample

2.2.2 線性關(guān)系 按線性關(guān)系考察方法操作，將結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表9。

2.2.3 精密度試驗和重復(fù)性試驗 按精密度和重復(fù)性考察方法操作，記錄峰面積，精密度實驗計算得到樣品中3 種有效成分峰面積的RSD%分別為R1=0.45%，Rb1=0.23%，Rg1=0.09%，結(jié)果表明儀器精密度和操作精密度良好；重復(fù)性實驗計算得到樣品中3 種有效成分峰面積的RSD%分別為R1=1.59%，Rb1=0.51%，Rg1=0.54%均符合規(guī)定，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 按穩(wěn)定性考察方法操作，記錄峰面積，穩(wěn)定性實驗計算得到樣品中3 種有效成分峰面積的RSD%分別為R1=1.45%，Rb1=1.41%，Rg1=0.81%，結(jié)果表明樣品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率 按加樣回收率考察方法操作，記錄峰面積，計算得到樣品中3 種有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Rg1的加樣回收率，具體結(jié)果見表10，加樣回收率均在各自范圍內(nèi)，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度可靠。

2.3 含量測定結(jié)果

按含量測定方法操作，記錄保留時間及峰面積，將所得結(jié)果帶入表9 下3 種皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算云南不同產(chǎn)地三七樣品中3種皂苷的含量，結(jié)果見表11。

表9 三七皂苷、人參皂苷的回歸方程Tab.9 The regression equation of panax notoginseng Saponins，ginsenoside

表10 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Tab.10 The result of recovery rate test

2.4 指紋圖譜結(jié)果

按2.4 下方法操作，記錄色譜圖，分析可得：組分在60 min 內(nèi)出峰完全，檢測系統(tǒng)無干擾峰，樣品出峰個數(shù)為32 個，對比保留時間，確定樣品中tR=22.805 min 峰為人參皂苷Rb1，人參皂苷Rb1與相鄰峰分離良好，選做參照峰（S），確定23 個共有峰，共有峰總數(shù)比例達(dá)到71.88%，計算共有峰的相對保留時間的RSD（%）為0.001%～0.018%（表12）。同時導(dǎo)入HPLC 色譜分離圖，采用藥典委員會推薦的中藥色譜指紋評價系統(tǒng)進(jìn)行疊加比較，見圖3。

3 討論

藥理資料證明三七具有抗血栓、改善心血管功能和很強(qiáng)的止血作用。三七主要以地下部位入藥，其主要成分為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷，其中以人參皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1的含量最高。主要皂苷成分的含量是三七藥材品質(zhì)分析的重要指標(biāo)。

在前期實驗中，通過單因素實驗探索提取時間、料液比、溶劑體積分?jǐn)?shù)對三七中3 種主要指標(biāo)成分的提取率的最佳提取參數(shù)，利用L9（34）正交試驗設(shè)計得出最佳工藝條件為提取時間30min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇體積分?jǐn)?shù)60%。本實驗所采用的超聲提取法提取三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1，該方法具有耗時短、效率高、耗能少等優(yōu)點。

表11 云南省不同產(chǎn)地三七中3 種主要皂苷含量結(jié)果Tab.11 The results of three main saponins content in panax notoginseng from YunNan different places

表12 21 批藥材共有指紋峰的相對保留時間（1）Tab.12 The common peaks,relative retention time of 21 batches（1）

表12 21 批藥材共有指紋峰的相對保留時間（2）Tab.12 The common peaks,relative retention time of 21 batches（2）

圖3 三七的高效液相色譜疊加圖Fig.3 The overlaied HPLC chromatograms of Panax Notoginseng

中華人民共和國藥典2015 版[1]采用HPLC 法對三七中的人參皂苷Rg1、Rb1、及三七皂苷R1進(jìn)行定量[7]，本試驗所建立的含量測定方法基于2015版中華人民共和國藥典方法對流動相梯度進(jìn)行優(yōu)化而得，其具有簡便、準(zhǔn)確，精密度和重復(fù)性均好等特點，可用于三七藥材中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量測定。

含量測定結(jié)果表明云南不同產(chǎn)地三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb13 種主要皂苷含量之和在5.30%～9.95%之間，均大于藥典規(guī)定值5.0%，達(dá)到《中國藥典》[1]對三七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

從表12 可知：三七樣品中共有峰占總峰的比例達(dá)到71.88%，相對保留時間的RSD（%）為0.001%～0.018%。綜合含量測定結(jié)果與共有峰的相對保留時間RSD（%），可看出不同產(chǎn)地三七樣品所含物質(zhì)基本一致，且三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb13 種主要皂苷含量已達(dá)2015 版《中國藥典》規(guī)定。隨著市場需求的增加，三七出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面，本實驗研究結(jié)果為異地種植三七提供技術(shù)支持。

本實驗通過測定三種皂苷含量及共有峰的相對保留時間RSD（%）對云南不同產(chǎn)地三七進(jìn)行質(zhì)量分析，方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確度高。與單獨控制三種皂苷的含量相比，增加藥材的HPLC 指紋圖譜，對藥材的全面質(zhì)量控制大有增益。此外，本方法也可用于其他地區(qū)產(chǎn)三七的質(zhì)量分析和質(zhì)量評價。